益肾壮骨颗粒剂对人工关节生物因素松动的影响(2)
参见附件(12kb)。
1.3 实验方法 无菌采集准备行人工髋关节置换术患者外周血10mL，用肝素抗凝。抗凝血以HANK'S液稀释一倍后，用FICOLL分离液梯度离心法分离出单个核细胞。洗涤3次，加含10%小牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液，细胞记数，调整细胞至4×105 mL-1。台盼蓝排除法检测细胞活力；向6孔培养板中滴加细胞悬液，每孔加3mL，最后一孔空置。置37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱培育4h，使细胞贴壁，利用单个核细胞的贴壁性，洗去非贴壁细胞，留下单个核细胞。每板第1孔加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液3mL，余4孔中加入含10mg·mL-1骨水泥的RPMI1640培养液3mL，并于第3、第4和第5孔中分别加入9、18、36mg益肾壮骨颗粒剂，使其浓度分别为3、6、12mg·mL-1。即第一孔为仅有单个核细胞的正常对照组，第2孔为单个核细胞+骨水泥的模型组，第3孔为单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒低剂量组(3mg·mL-1)，第4孔为单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒中剂量组(6mg·mL-1)，第5孔为单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒高剂量组(12mg·mL-1)。混匀，同条件培养48 h，取上清液，水平离心机以1500r/min×10min离心。ELISA测定细胞上清液中肿瘤坏死因子TNF-α含量和白细胞介素IL-6含量。
1.4 数据处理 数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析q检验法检测不同处理组之间TNF-α和IL-6含量的差异有无统计学意义。
2 结 果
2.1 TNF-α含量测定结果 见表1。
表1 五组不同处理组TNF-α的含量(±s)
注：与正常对照组比较，ΔP<0.01;与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
方差分析提示：模型组(单个核细胞+骨水泥)TNF-α含量高于正常对照组(P<0.01)。单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒剂低剂量组的TNF-α含量低于模型组(P<0.05)；益肾壮骨颗粒剂中、高剂量组的TNF-α含量均明显低于模型组(P<0.01)。而3种不同浓度的益肾壮骨颗粒剂组中的TNF-α含量无明显差异。
2.2 IL-6含量测定结果 见表2。
表2 5组不同处理组IL-6的含量(±s)
注：与正常对照组比较，ΔP<0.01；与模型组比较，*P<0.01。
方差分析提示：模型组的IL-6含量高于正常对照组(P<0.01)。益肾壮骨颗粒剂低、中、高剂量组的IL-6含量均明显低于模型组(P<0.01)。而3种不同浓度的益肾壮骨颗粒剂组中的IL-6含量无明显差异。
3 讨 论
人工关节置换历经30年的发展和改进，长期保留了病变关节的功能，明显提高了患者的工作能力和生活质量。随着人工关节使用年限的延长，人工关节无菌性松动这一问题逐渐显得重要起来，虽然随着第二、三代骨水泥技术和生物式固定技术的发展，人工关节无菌性松动的发生率有所下降，但这一问题仍未得到彻底解决，而且已成为人工关节置换术远期失败的最主要原因，并严重影响了人工关节的发展和推广运用。大多学者认为，磨损微粒诱导破骨细胞性骨溶解是人工关节松动的关键。不同的假体材料产生不同的磨损微粒，主要有：骨水泥微粒(PMMA)、超高分子量聚乙烯微粒(UHMWPE)、钛合金微粒(Ti-6Al-4V)和钴铬合金微粒(CoCr)。其过程是：假体磨损产生磨损微粒，刺激巨噬细胞释放多种细胞因子(TNF-α，IL-6等)，其中TNF-α与无菌性松动的关系最为密切。这些细胞因子通过多种途径产生一系列生物反应，最终导致骨吸收和人工关节松动。
二膦酸盐能抑制骨吸收，并在骨质疏松症的治疗中取得成功。因此，有学者尝试用二膦酸盐来治疗微粒引起的假体松动。1995年Pennanen等[3]将二磷酸盐加入巨噬细胞raw264培养液中，经过培养后，发现二磷酸盐能明显抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6等溶骨性因子。范卫民等[4]也认为二磷酸盐可明显抑制TNF-α的分泌，从而抑制骨溶解，防治人工关节无菌性松动。益肾壮骨颗粒剂在我们以往研究防治骨质疏松中发现[2]，该药具有抑制骨吸收作用，骨组织形态剂量学检测显示，治疗组的破骨细胞数和骨吸收陷窝数显著低于模型组；且益肾壮骨颗粒剂具有整体调治作用 ......
1.3 实验方法 无菌采集准备行人工髋关节置换术患者外周血10mL，用肝素抗凝。抗凝血以HANK'S液稀释一倍后，用FICOLL分离液梯度离心法分离出单个核细胞。洗涤3次，加含10%小牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液，细胞记数，调整细胞至4×105 mL-1。台盼蓝排除法检测细胞活力；向6孔培养板中滴加细胞悬液，每孔加3mL，最后一孔空置。置37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱培育4h，使细胞贴壁，利用单个核细胞的贴壁性，洗去非贴壁细胞，留下单个核细胞。每板第1孔加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液3mL，余4孔中加入含10mg·mL-1骨水泥的RPMI1640培养液3mL，并于第3、第4和第5孔中分别加入9、18、36mg益肾壮骨颗粒剂，使其浓度分别为3、6、12mg·mL-1。即第一孔为仅有单个核细胞的正常对照组，第2孔为单个核细胞+骨水泥的模型组，第3孔为单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒低剂量组(3mg·mL-1)，第4孔为单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒中剂量组(6mg·mL-1)，第5孔为单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒高剂量组(12mg·mL-1)。混匀，同条件培养48 h，取上清液，水平离心机以1500r/min×10min离心。ELISA测定细胞上清液中肿瘤坏死因子TNF-α含量和白细胞介素IL-6含量。
1.4 数据处理 数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析q检验法检测不同处理组之间TNF-α和IL-6含量的差异有无统计学意义。
2 结 果
2.1 TNF-α含量测定结果 见表1。
表1 五组不同处理组TNF-α的含量(±s)
注：与正常对照组比较，ΔP<0.01;与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。
方差分析提示：模型组(单个核细胞+骨水泥)TNF-α含量高于正常对照组(P<0.01)。单个核细胞+骨水泥+益肾壮骨颗粒剂低剂量组的TNF-α含量低于模型组(P<0.05)；益肾壮骨颗粒剂中、高剂量组的TNF-α含量均明显低于模型组(P<0.01)。而3种不同浓度的益肾壮骨颗粒剂组中的TNF-α含量无明显差异。
2.2 IL-6含量测定结果 见表2。
表2 5组不同处理组IL-6的含量(±s)
注：与正常对照组比较，ΔP<0.01；与模型组比较，*P<0.01。
方差分析提示：模型组的IL-6含量高于正常对照组(P<0.01)。益肾壮骨颗粒剂低、中、高剂量组的IL-6含量均明显低于模型组(P<0.01)。而3种不同浓度的益肾壮骨颗粒剂组中的IL-6含量无明显差异。
3 讨 论
人工关节置换历经30年的发展和改进，长期保留了病变关节的功能，明显提高了患者的工作能力和生活质量。随着人工关节使用年限的延长，人工关节无菌性松动这一问题逐渐显得重要起来，虽然随着第二、三代骨水泥技术和生物式固定技术的发展，人工关节无菌性松动的发生率有所下降，但这一问题仍未得到彻底解决，而且已成为人工关节置换术远期失败的最主要原因，并严重影响了人工关节的发展和推广运用。大多学者认为，磨损微粒诱导破骨细胞性骨溶解是人工关节松动的关键。不同的假体材料产生不同的磨损微粒，主要有：骨水泥微粒(PMMA)、超高分子量聚乙烯微粒(UHMWPE)、钛合金微粒(Ti-6Al-4V)和钴铬合金微粒(CoCr)。其过程是：假体磨损产生磨损微粒，刺激巨噬细胞释放多种细胞因子(TNF-α，IL-6等)，其中TNF-α与无菌性松动的关系最为密切。这些细胞因子通过多种途径产生一系列生物反应，最终导致骨吸收和人工关节松动。
二膦酸盐能抑制骨吸收，并在骨质疏松症的治疗中取得成功。因此，有学者尝试用二膦酸盐来治疗微粒引起的假体松动。1995年Pennanen等[3]将二磷酸盐加入巨噬细胞raw264培养液中，经过培养后，发现二磷酸盐能明显抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6等溶骨性因子。范卫民等[4]也认为二磷酸盐可明显抑制TNF-α的分泌，从而抑制骨溶解，防治人工关节无菌性松动。益肾壮骨颗粒剂在我们以往研究防治骨质疏松中发现[2]，该药具有抑制骨吸收作用，骨组织形态剂量学检测显示，治疗组的破骨细胞数和骨吸收陷窝数显著低于模型组；且益肾壮骨颗粒剂具有整体调治作用 ......
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