人参皂苷Rg3联合紫杉醇抗胃癌转移的作用及机制研究(2)
参见附件(12kb)。
(1)生理盐水组：0.2mL/d，腹腔注射，连续21天。
(2)人参皂苷Rg3组：10mg/kg/d，灌胃，连续21天。人参皂苷Rg3：纯度为99%粉剂标准品，购于大连富生制药有限公司。
(3)紫杉醇组：10mg/kg/次，腹腔注射，每周2次，连用3周。药物购于海南轻骑制药有限公司。
(4)联合给药组：人参皂苷Rg3和紫杉醇用法与用量、时间同上。
1.3 用药后抗肿瘤作用的观察
1.3.1 小鼠一般状态和生存状态的观察 给药后第1天起，每日观察动物进食、活动状态及死亡情况，并记录。
1.3.2 实验移植瘤裸鼠 采用颈椎脱臼法处死实验裸鼠，迅速完整剥离移植瘤结节，同时分离裸鼠的肝脏、肾脏、肺脏、脾脏和淋巴结等放在10%中性缓冲福尔马林(pH7.4)固定液中固定,常规病理HE染色和观察肿瘤细胞的转移情况。随后将移植瘤结节的一部分放入预先消毒和DEPC处理过的冻存管中立即置于液氮中，用作RT-PCR实验。一部分立即放在10%中性缓冲福尔马林(pH7.4)固定液中固定，做石蜡包埋和切片,作常规HE染色和免疫组织化学染色。计算转移率:转移率%＝(有转移动物数/动物总数)×100%。
1.4 统计学分析
对实验计量资料结果表示为±s,应用SPSS 11.5软件包,采用单因素的方差分析(one-way ANOVA)处理,样本均数间两两比较用LSD检验。计数资料采用卡方检验。对于双变量的相关分析采用Pearson相关分析。取双侧P<0.05为具有统计学意义。
2 结 果
2.1 人参皂苷Rg3和紫杉醇对移植瘤裸鼠的肾脏和肝脏等转移情况观察
通过大体观察和HE染色切片观察肿瘤的转移情况，肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结任何一个以上脏器或组织有转移灶或出现癌性腹水即被认定为有转移。在转移的肺组织,肝脏和肾脏,淋巴结等在其大体的表面和切面上呈散在分布的0.1～0.3mm大小的灰白色单个或多个颗粒(见图1),经过病理常规HE染色观察转移癌灶的肿瘤细胞形态与腋下的BGC-823移植瘤的肿瘤细胞形态一致(见图2和3)；癌性腹水指腹水离心涂片染色后也能找到肿瘤细胞。结果发现生理盐水组肿瘤转移率最高，全部10只裸鼠有9只发生转移。而联合组肿瘤转移率最低10%,联合组肿瘤转移率与紫杉醇组和人参皂苷Rg3组比有差异(P<0.05，P<0.01)。人参皂苷Rg3肿瘤转移率为40%，紫杉醇组为50%，人参皂苷Rg3低于紫杉醇组，但统计学无明显差异(P>0.05)。上述3组与生理盐水组比均有差异(P<0.05，P<0.01) 见表1。
图1 肝转移灶,灰白色单个或多个颗粒
2.2 人参皂苷Rg3和紫杉醇对人胃癌移植瘤内的微血管密度(MVD)的影响
用免疫组化EnvisionTM两步法抗CD31抗体标记移植瘤内血管的内皮细胞，计算微血管密度-MVD，结果显示人参皂苷Rg3和紫杉醇均可显著降低移植瘤的微血管密度，抑制肿瘤新生微血管形成(P<0.01和P<0.05)；同时发现人参皂苷Rg3组MVD较紫杉醇降低明显(P<0.05);且联合组MVD较单用人参皂苷Rg3或紫杉醇更显著降低(P<0.05和P<0.01)。详见图4～7及表2。
表1 Rg3和紫杉醇对人胃癌移植瘤转移的影响
注：与生理盐水组比较aP<0.05，bP<0.01；与联合组比较*P<0.01，**P<0.05。
表2 Rg3和紫杉醇对人胃癌移植瘤微血管密度的影响(±s)
注：与生理盐水组比较aP<0.05，bP<0.01；与联合组比较*P<0.05，**P<0.01。
2.3 人参皂苷Rg3和紫杉醇对人胃癌移植瘤β3-integrin的mRNA水平表达的影响
RT-PCR检测血管生成因子β3-integrin mRNA的表达，人参皂苷Rg3组和紫杉醇组及联合组均可显著降低β3-integrin mRNA的表达(P<0.01，P<0.05)，联合组β3-integrin的mRNA表达较单纯人参皂苷Rg3组或紫杉醇组低(P<0.05)，人参皂苷Rg3对β3-integrin mRNA的表达与紫杉醇组比较无显著性差异(P>0.05) ......
(1)生理盐水组：0.2mL/d，腹腔注射，连续21天。
(2)人参皂苷Rg3组：10mg/kg/d，灌胃，连续21天。人参皂苷Rg3：纯度为99%粉剂标准品，购于大连富生制药有限公司。
(3)紫杉醇组：10mg/kg/次，腹腔注射，每周2次，连用3周。药物购于海南轻骑制药有限公司。
(4)联合给药组：人参皂苷Rg3和紫杉醇用法与用量、时间同上。
1.3 用药后抗肿瘤作用的观察
1.3.1 小鼠一般状态和生存状态的观察 给药后第1天起，每日观察动物进食、活动状态及死亡情况，并记录。
1.3.2 实验移植瘤裸鼠 采用颈椎脱臼法处死实验裸鼠，迅速完整剥离移植瘤结节，同时分离裸鼠的肝脏、肾脏、肺脏、脾脏和淋巴结等放在10%中性缓冲福尔马林(pH7.4)固定液中固定,常规病理HE染色和观察肿瘤细胞的转移情况。随后将移植瘤结节的一部分放入预先消毒和DEPC处理过的冻存管中立即置于液氮中，用作RT-PCR实验。一部分立即放在10%中性缓冲福尔马林(pH7.4)固定液中固定，做石蜡包埋和切片,作常规HE染色和免疫组织化学染色。计算转移率:转移率%＝(有转移动物数/动物总数)×100%。
1.4 统计学分析
对实验计量资料结果表示为±s,应用SPSS 11.5软件包,采用单因素的方差分析(one-way ANOVA)处理,样本均数间两两比较用LSD检验。计数资料采用卡方检验。对于双变量的相关分析采用Pearson相关分析。取双侧P<0.05为具有统计学意义。
2 结 果
2.1 人参皂苷Rg3和紫杉醇对移植瘤裸鼠的肾脏和肝脏等转移情况观察
通过大体观察和HE染色切片观察肿瘤的转移情况，肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结任何一个以上脏器或组织有转移灶或出现癌性腹水即被认定为有转移。在转移的肺组织,肝脏和肾脏,淋巴结等在其大体的表面和切面上呈散在分布的0.1～0.3mm大小的灰白色单个或多个颗粒(见图1),经过病理常规HE染色观察转移癌灶的肿瘤细胞形态与腋下的BGC-823移植瘤的肿瘤细胞形态一致(见图2和3)；癌性腹水指腹水离心涂片染色后也能找到肿瘤细胞。结果发现生理盐水组肿瘤转移率最高，全部10只裸鼠有9只发生转移。而联合组肿瘤转移率最低10%,联合组肿瘤转移率与紫杉醇组和人参皂苷Rg3组比有差异(P<0.05，P<0.01)。人参皂苷Rg3肿瘤转移率为40%，紫杉醇组为50%，人参皂苷Rg3低于紫杉醇组，但统计学无明显差异(P>0.05)。上述3组与生理盐水组比均有差异(P<0.05，P<0.01) 见表1。
图1 肝转移灶,灰白色单个或多个颗粒
2.2 人参皂苷Rg3和紫杉醇对人胃癌移植瘤内的微血管密度(MVD)的影响
用免疫组化EnvisionTM两步法抗CD31抗体标记移植瘤内血管的内皮细胞，计算微血管密度-MVD，结果显示人参皂苷Rg3和紫杉醇均可显著降低移植瘤的微血管密度，抑制肿瘤新生微血管形成(P<0.01和P<0.05)；同时发现人参皂苷Rg3组MVD较紫杉醇降低明显(P<0.05);且联合组MVD较单用人参皂苷Rg3或紫杉醇更显著降低(P<0.05和P<0.01)。详见图4～7及表2。
表1 Rg3和紫杉醇对人胃癌移植瘤转移的影响
注：与生理盐水组比较aP<0.05，bP<0.01；与联合组比较*P<0.01，**P<0.05。
表2 Rg3和紫杉醇对人胃癌移植瘤微血管密度的影响(±s)
注：与生理盐水组比较aP<0.05，bP<0.01；与联合组比较*P<0.05，**P<0.01。
2.3 人参皂苷Rg3和紫杉醇对人胃癌移植瘤β3-integrin的mRNA水平表达的影响
RT-PCR检测血管生成因子β3-integrin mRNA的表达，人参皂苷Rg3组和紫杉醇组及联合组均可显著降低β3-integrin mRNA的表达(P<0.01，P<0.05)，联合组β3-integrin的mRNA表达较单纯人参皂苷Rg3组或紫杉醇组低(P<0.05)，人参皂苷Rg3对β3-integrin mRNA的表达与紫杉醇组比较无显著性差异(P>0.05) ......
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