羊栖菜多糖对软脂酸诱导的HL-7702细胞凋亡的保护作用(2)
参见附件(12kb)。
1 材料与方法
1.1 主要材料 正常人肝细胞株HL-7702由本实验室保存。羊栖菜(SFPS，温州医学院)；软脂酸(PA，sigma公司)； DMEM高糖培养基(Hyclone公司)；优级胎牛血清(杭州四季青生物公司)；青霉素、链霉素、胰酶(碧云天生物技术研究所)；四甲基偶氮唑盐(MTT，北京索来宝生物公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Biovision公司)；TRIzol Reagent(invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒(Fermantas公司)；Bcl-2、Bax基因序列由Genbank数据库提供，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。GAPDH引物：上游TGTTGCCATCAATGACCCCTT，下游CTCCACG ACGTACTCAGCG；Bcl-2引物：上游CTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTC，下游CGGTGCTTGGC AATTAGTGGTC；Bax引物：上游CTCAGGATGCGTCCACCA AGAA，下游CACAAAGATGGTCACGGTCTGC。其他试剂均为进口或国产分析纯品。
1.2 HL-7702细胞的培养与传代 细胞复苏后以5×105/瓶接种于25cm2细胞培养瓶 (Corning)，以完全培养基 (DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+1%青链双抗)在37℃、5%CO2培养箱培养，3天传代1次。
1.3 HL-7702细胞PA损伤模型的建立和分组 HL-7702细胞接种到多孔培养板贴壁培养24h，随机分为正常对照组、PA模型组、SFPS-L组(25μg/mL)、SFPS-M组(50μg/mL)、SFPS-H组(100μg/mL)。正常对照组：含5%胎牛血清培养基继续培养24h后，无血清培养基培养48h。PA模型组：继续培养24h后，0.5mmol/L PA作用48h。SFPS组：分别加入25、50、100μg/mL SFPS预处理24h，再加入0.5mmol/L PA作用48h。然后进行相应指标的测定。
1.4 MTT法检测细胞增殖活力 传代后以0.8×104/孔接种于96孔板，按分组处理，终止培养前4h每孔加入10μL MTT (5 mg/mL)，培养结束时小心吸除上清，加100μL DMSO /孔，振荡10 min溶解结晶物，酶标仪490nm波长测各组OD值。每组6个复孔。以正常对照组A值为对照，计算各组细胞存活率。细胞存活率(%)(各组A值/正常对照组A值)。
1.5 Annexin V-FITC/PI标记法检测细胞凋亡 收集各组细胞，用4℃预冷的PBS洗涤2次。300μL结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为3×105，加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，混匀后于室温避光孵育5 min，流式细胞仪(Becton Dickinson, FACS Vantage SE)分析结果。
1.6 RT-PCR法检测Bcl-2、Bax mRNA的表达 收集各组细胞，分别按Trizol试剂盒和RT-PCR试剂盒说明书的标准步骤操作来提取总RNA和合成cDNA。Bcl-2基因PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30S，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min。Bax基因：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30S，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min。内参GAPDH：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min。反应结束后取PCR产物在含溴化乙啶的1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离，使用凝胶分析系统获得凝胶电泳图像，再使用GenePro图像分析软件进行PCR产物条带分析。为了减少误差，以目的基因与内参的比值代替目的基因进行统计分析。
1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学处理 ......
1 材料与方法
1.1 主要材料 正常人肝细胞株HL-7702由本实验室保存。羊栖菜(SFPS，温州医学院)；软脂酸(PA，sigma公司)； DMEM高糖培养基(Hyclone公司)；优级胎牛血清(杭州四季青生物公司)；青霉素、链霉素、胰酶(碧云天生物技术研究所)；四甲基偶氮唑盐(MTT，北京索来宝生物公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Biovision公司)；TRIzol Reagent(invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒(Fermantas公司)；Bcl-2、Bax基因序列由Genbank数据库提供，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。GAPDH引物：上游TGTTGCCATCAATGACCCCTT，下游CTCCACG ACGTACTCAGCG；Bcl-2引物：上游CTGTTTGATTTCTCCTGGCTGTC，下游CGGTGCTTGGC AATTAGTGGTC；Bax引物：上游CTCAGGATGCGTCCACCA AGAA，下游CACAAAGATGGTCACGGTCTGC。其他试剂均为进口或国产分析纯品。
1.2 HL-7702细胞的培养与传代 细胞复苏后以5×105/瓶接种于25cm2细胞培养瓶 (Corning)，以完全培养基 (DMEM高糖培养基+10%胎牛血清+1%青链双抗)在37℃、5%CO2培养箱培养，3天传代1次。
1.3 HL-7702细胞PA损伤模型的建立和分组 HL-7702细胞接种到多孔培养板贴壁培养24h，随机分为正常对照组、PA模型组、SFPS-L组(25μg/mL)、SFPS-M组(50μg/mL)、SFPS-H组(100μg/mL)。正常对照组：含5%胎牛血清培养基继续培养24h后，无血清培养基培养48h。PA模型组：继续培养24h后，0.5mmol/L PA作用48h。SFPS组：分别加入25、50、100μg/mL SFPS预处理24h，再加入0.5mmol/L PA作用48h。然后进行相应指标的测定。
1.4 MTT法检测细胞增殖活力 传代后以0.8×104/孔接种于96孔板，按分组处理，终止培养前4h每孔加入10μL MTT (5 mg/mL)，培养结束时小心吸除上清，加100μL DMSO /孔，振荡10 min溶解结晶物，酶标仪490nm波长测各组OD值。每组6个复孔。以正常对照组A值为对照，计算各组细胞存活率。细胞存活率(%)(各组A值/正常对照组A值)。
1.5 Annexin V-FITC/PI标记法检测细胞凋亡 收集各组细胞，用4℃预冷的PBS洗涤2次。300μL结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为3×105，加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，混匀后于室温避光孵育5 min，流式细胞仪(Becton Dickinson, FACS Vantage SE)分析结果。
1.6 RT-PCR法检测Bcl-2、Bax mRNA的表达 收集各组细胞，分别按Trizol试剂盒和RT-PCR试剂盒说明书的标准步骤操作来提取总RNA和合成cDNA。Bcl-2基因PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30S，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min。Bax基因：94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30S，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸7min。内参GAPDH：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min。反应结束后取PCR产物在含溴化乙啶的1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离，使用凝胶分析系统获得凝胶电泳图像，再使用GenePro图像分析软件进行PCR产物条带分析。为了减少误差，以目的基因与内参的比值代替目的基因进行统计分析。
1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学处理 ......
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