响应面优化酶法提取平菇多糖工艺研究(2)
参见附件(12kb)。
2.2.2 供试品溶液的制备 将“2.1”所得的多糖沉淀加水溶解，定容至100mL容量瓶中，摇匀，精密量取1 mL，定容至25mL容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。
2.2.3 最大吸收波长的确定 吸取一定量的标准葡萄糖对照品溶液，置于比色管中，加水至2mL，加1mL 5%苯酚后，立即加入5mL浓硫酸混匀，静止10min，摇匀，室温放置20min。同时取2mL水同法操作，作为空白对照。样品溶液分别于450～550nm处测吸光度，确定其最大吸收波长。根据预实验结果，吸收波长为490nm时，样品溶液的吸光度最大，故本实验选取的吸收波长为490nm。
2.2.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL于比色管中，各以水补至2.0mL后加入5 %苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，混匀，静止10min，摇匀，室温放置20min后于490nm测定吸光度，以2.0mL水按同样显色操作为空白对照，以多糖浓度为横坐标，测定的吸光度值为纵坐标，得标准曲线y6.6964x+0.0084，r0.9995。表明葡萄糖检测浓度在0.008～0.072mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.2.5 精密度试验 精密吸取葡萄糖标准溶液1.0mL，自“以水补至2.0mL”起按“2.2.4”操作，重复测定6次，结果吸光度的RSD为0.67%(n6)，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 精密吸取葡萄糖标准品溶液和供试品溶液各1.0mL，自“以水补至2.0mL”起按“2.2.4”操作，1h内每隔10min于490nm处测定吸光度。结果对照品和样品吸光度的RSD分别为0.69%和0.75%，表明对照品溶液和样品溶液在显色后1h内稳定。
2.2.7 重复性试验 将多糖沉淀加水溶解后定容至100mL容量瓶中，摇匀，按“2.2.2”项配制供试品6份，各精密吸取1.0mL，自“以水补至2.0mL”按“2.2.4”操作，分别测定吸光度，结果吸光度的RSD为0.55%(n6)，表明该法重复性良好。
2.2.8 加样回收率试验 将多糖沉淀加水溶解后定容至100mL容量瓶中，摇匀，按“2.2.2”项配制供试品9份，各精密吸取0.5mL供试品溶液，分别加入葡糖糖含量是供试品溶液80%、100%、120%的对照品溶液，自“以水补至2.0mL”起按“2.2.4”操作测定吸光度，计算回收率。结果见表1。平均回收率为99.60%，RSD为1.57%，表明方法的准确性良好。
表1 加样回收率试验结果
2.3 提取条件优化
根据单因素考察结果以及文献报道[9]，选取酶解时间、酶解温度、pH3项作为考察因素，采用3因素3水平的响应面分析法进行试验，以多糖得率为检测指标，优化提取条件。具体因素水平及实验结果见表2、表3、表4及图1～6。
表2 响应面分析因素与水平
表3 响应面分析方案及结果
注：共有15个实验，其中12个是析因实验，3个为中心实验以估计误差。
各因素经回归拟合后，解得回归方程为：Y6.68+0.084X1-0.18X2+0.13 X3-0.18 X1X2+0.17 X1X3+0.33X2X3-0.20X12-0.49X22-0.18X32
式中，Y为多糖得率(%)，X1为酶解时间(min)，X2为酶解温度(℃)，X3为pH。
回归分析结果如表3所示，当“Prob>F”值小于0.05即表示该项指标显著，从表3的分析结果来看，整体模型的“Prob>F”值小于0.01，表明该模拟二次方程高度显著，说明这种实验方法是可靠的，使用该方程模拟真实的3因素3水平的分析是可行的。由表3的“Prob>F”值可以知道，在所选的各因素水平范围内，对结果的影响排序为：酶解温度>pH>酶解时间。其中，X2、X2X3和X22对Y的影响非常显著，X3、X1X2、X1X3 、X12和X32对Y的影响显著 ......
2.2.2 供试品溶液的制备 将“2.1”所得的多糖沉淀加水溶解，定容至100mL容量瓶中，摇匀，精密量取1 mL，定容至25mL容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液。
2.2.3 最大吸收波长的确定 吸取一定量的标准葡萄糖对照品溶液，置于比色管中，加水至2mL，加1mL 5%苯酚后，立即加入5mL浓硫酸混匀，静止10min，摇匀，室温放置20min。同时取2mL水同法操作，作为空白对照。样品溶液分别于450～550nm处测吸光度，确定其最大吸收波长。根据预实验结果，吸收波长为490nm时，样品溶液的吸光度最大，故本实验选取的吸收波长为490nm。
2.2.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL于比色管中，各以水补至2.0mL后加入5 %苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，混匀，静止10min，摇匀，室温放置20min后于490nm测定吸光度，以2.0mL水按同样显色操作为空白对照，以多糖浓度为横坐标，测定的吸光度值为纵坐标，得标准曲线y6.6964x+0.0084，r0.9995。表明葡萄糖检测浓度在0.008～0.072mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.2.5 精密度试验 精密吸取葡萄糖标准溶液1.0mL，自“以水补至2.0mL”起按“2.2.4”操作，重复测定6次，结果吸光度的RSD为0.67%(n6)，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 精密吸取葡萄糖标准品溶液和供试品溶液各1.0mL，自“以水补至2.0mL”起按“2.2.4”操作，1h内每隔10min于490nm处测定吸光度。结果对照品和样品吸光度的RSD分别为0.69%和0.75%，表明对照品溶液和样品溶液在显色后1h内稳定。
2.2.7 重复性试验 将多糖沉淀加水溶解后定容至100mL容量瓶中，摇匀，按“2.2.2”项配制供试品6份，各精密吸取1.0mL，自“以水补至2.0mL”按“2.2.4”操作，分别测定吸光度，结果吸光度的RSD为0.55%(n6)，表明该法重复性良好。
2.2.8 加样回收率试验 将多糖沉淀加水溶解后定容至100mL容量瓶中，摇匀，按“2.2.2”项配制供试品9份，各精密吸取0.5mL供试品溶液，分别加入葡糖糖含量是供试品溶液80%、100%、120%的对照品溶液，自“以水补至2.0mL”起按“2.2.4”操作测定吸光度，计算回收率。结果见表1。平均回收率为99.60%，RSD为1.57%，表明方法的准确性良好。
表1 加样回收率试验结果
2.3 提取条件优化
根据单因素考察结果以及文献报道[9]，选取酶解时间、酶解温度、pH3项作为考察因素，采用3因素3水平的响应面分析法进行试验，以多糖得率为检测指标，优化提取条件。具体因素水平及实验结果见表2、表3、表4及图1～6。
表2 响应面分析因素与水平
表3 响应面分析方案及结果
注：共有15个实验，其中12个是析因实验，3个为中心实验以估计误差。
各因素经回归拟合后，解得回归方程为：Y6.68+0.084X1-0.18X2+0.13 X3-0.18 X1X2+0.17 X1X3+0.33X2X3-0.20X12-0.49X22-0.18X32
式中，Y为多糖得率(%)，X1为酶解时间(min)，X2为酶解温度(℃)，X3为pH。
回归分析结果如表3所示，当“Prob>F”值小于0.05即表示该项指标显著，从表3的分析结果来看，整体模型的“Prob>F”值小于0.01，表明该模拟二次方程高度显著，说明这种实验方法是可靠的，使用该方程模拟真实的3因素3水平的分析是可行的。由表3的“Prob>F”值可以知道，在所选的各因素水平范围内，对结果的影响排序为：酶解温度>pH>酶解时间。其中，X2、X2X3和X22对Y的影响非常显著，X3、X1X2、X1X3 、X12和X32对Y的影响显著 ......
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