活血利水法对兔外伤性玻璃体视网膜病变增殖膜上整合素β1表达的影响(2)
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增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy ,PVR) ,指在裂孔源性视网膜脱离或视网膜复位术后,由于视网膜色素上皮(RPE) 细胞和神经胶质细胞的增生和收缩,又造成牵拉性视网膜脱离的病变。由于眼球穿通伤后的眼内纤维组织增生,称为外伤性PVR。目前认为，在炎症刺激下的纤维组织增生和玻璃体或视网膜在伤口的嵌顿，是其主要的发病机制【sup】[1]【/sup】。临床上目前主要采取玻璃体手术治疗，但手术治疗并不能有效阻止细胞的迁移增生，甚至刺激其加重，从而导致PVR的复发。外伤性PVR 在中医学归属于云雾移睛、视瞻昏渺等眼病的范畴。前期研究表明【sup】[2-3]【/sup】，散血明目片能有效清除玻璃体积血，防治tPVR，并对视网膜具有保护性作用【sup】[4]【/sup】。本实验旨在通过对实验性外伤性PVR模型兔采用活血利水法、活血化瘀法、利水明目法治疗后，对各组增殖膜(ERM)中整合素β1表达进行对比观察，进一步阐明活血利水法(散血明目片)抑制外伤性PVR的作用及其机理。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 有色家兔40只，雌雄各半，体重2.0～2.5kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供。
1.1.2 药品及试剂 散血明目片：由三七、酒大黄、蒲黄、猪苓、防己、地龙、白茅根、泽泻、益母草等活血通脉利水明目中药按现代制剂制备工艺制成，0.3g/片，选用同一批号药物，批号：020624。由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。使用时研成粉末，温开水混合，浓度为100mL含散血明目片12g的混悬液。
止血去瘀明目片：由丹参、三七、赤芍、地黄、墨旱莲、茺蔚子、牡丹皮、女贞子、夏枯草、毛冬青、大黄、黄芩(酒炙)等制成，0.3g/片，选用同一批号的药物，批号：025316。陕西摩美得制药有限公司提供。使用时研成粉末，温开水混合，浓度为每100mL含止血去瘀明目片12g的混悬液。
猪苓散加减：猪苓10g，泽泻10g，茯苓15g，阿胶10g(烊)，滑石10g，车前子15g。使用时煎成汤剂，浓度为100mL含生药130g。
整合素β1试剂盒：由武汉博士德公司提供。
SABC免疫组织化学试剂盒：由武汉博士德公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组 40只有色家兔随机抽取8只(8只眼)作为空白组(A组)，其余32只(32只眼)造成右眼外伤性PVR模型，并随机分成模型组(B组)、活血化瘀组(C组、用止血去瘀明目片)、利水明目组(D组、用猪苓散)、活血利水组(E组、用散血明目片)，每组8只(8只眼)。
1.2.2 富含血小板的血浆(platelet-rich plasma,PRP)的制备【sup】[5]【/sup】 用含3.8%枸橼酸钠的玻璃离心管收集健康有色家兔耳缘静脉血(静脉血与枸橼酸钠体积比为9∶1),轻轻摇动混匀,室温下以50g之离心力离心10min,取上1/3之上清液,进行血小板计数,获得血小板浓度为5×10【sup】5【/sup】～10×10【sup】5【/sup】/mL的血浆,即PRP。
1.2.3 外伤性实验性PVR模型制作【sup】[6]【/sup】 有色家兔32只(体重2.0～2.5kg)，耳缘静脉注射乌拉坦4mL/kg。每只兔选右眼为实验眼，颞上方注入透明质酸酶0.1mL并反复抽吸,再分离3～9点的球结膜和筋膜，在角膜缘后4mm处用巩膜穿刺刀刺向玻璃体中心部，勿伤及晶状体及周边视网膜，用剪刀向两侧扩大切口，伤口与视网膜平行达8mm。轻压眼球，将脱离的玻璃体剪除，用8～0尼龙线间断缝合切口。玻璃体腔中央注入0.1mL的PRP(约含50,000个血小板)。术毕予地塞米松+庆大霉素各0.1mL球结膜下注射。造模后1周内每天用0.25%氯霉素滴眼液滴右眼，3次/天，0.5%托吡咔胺滴右眼，3次/天。
1.2.4 给药方法 造模后第3天开始给药，A组(空白组)与B组(模型组)均予温开水灌胃，5mL/kg,2次/天。C组(活血化瘀组)予止血去瘀明目片混悬液灌胃，0.6g/5mL/kg，2次/天。天组(利水明目组)予猪苓散汤剂灌胃6.5g/5mL/kg(每mL含生药1.3g)，2次/天。E组(活血利水组)，予散血明目片混悬液，按0.6g/5mL/kg灌胃, 2次/天。均相当于成人剂量。各组均灌胃30天。
1.2.5 观察指标与方法 (1)PVR分级：用直接检眼镜检查，观察PVR分级，采用Weiss的评级方法【sup】[7]【/sup】，将病变分为6级：0级：无增生；0.5级：玻璃体勉强可见增生痕迹；1级：细小的增生束，但无真正的条索形成；2级：有浓厚的增生束，但无真正的增生条索形成；3级：有细薄的增生条索；4级：有浓厚的增生条索。(2)组织学送检：光学显微镜检查：灌胃30天后，所有实验兔均用空气栓塞法处死，取出右眼球，采集完增殖膜标本后予固定液固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡和石蜡包埋后进行切片，片厚7mm，铺于载玻片上，常规进行HE染色，显微镜观察和摄影。(3)增殖膜整合素-β1的测定：采用免疫组化的方法进行检测。
1.2.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件包的秩和检验及方差分析，以P<0.05作为显著性标准。
2 结果与分析
2.1 一般情况
所有实验动物在实验观察期间进食及精神状态正常。结膜及角膜上皮无溃疡及糜烂缺损。
2.2 各组不同给药时期PVR分级情况
空白组玻璃体透明，视网膜结构清晰，灌胃30天眼底无明显变化。
给药后第1天，少部分兔眼眼底用检眼镜看不见视网膜红光反射，大部分玻璃体腔中可见界限清楚的雾状混浊，眼底视网膜结构可见。
给药后第7天，各组兔眼玻璃体中可见灰白色混沙状团块，少数可见灰白色细小条索。
给药后第14天，各组玻璃体中可见灰白色膜样混浊。模型组中玻璃体腔中出现大小不等的纤维增生条索；活血化瘀组与利水明目组亦有部分出现纤维增生条索，均较模型组少活血利水组可见增生束，未见增生条索。
给药后第21天，模型组中的纤维条索渐增大，少数眼可见较粗大的条索，并牵拉视网膜，开始出现局部视网膜脱离及视网膜皱褶；活血化瘀组及利水明目组玻璃体的条索较模型组少 ......
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