眼针对局灶脑缺血再灌注损伤保护机制研究(2)
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参见附件(5311KB，7页)。
1.6 标本制作
各组大鼠根据不同时间灌注固定取脑。重新测大鼠体重，10%水合氯醛 (600mg/kg )腹腔注射深度麻醉后，将鼠仰卧固定于大鼠固定架上，提起剑突下缘上腹部皮肤，纵行剪开胸前部皮肤直至锁骨上窝，提起剑突沿胸骨前壁剪开膈肌，沿胸骨旁线剪开前胸壁固定，剪开心包暴露心脏。从心尖部沿左心室插入灌注管至升主动脉入口，剪开右心耳，先用0.9%生理盐水150mL快速冲洗组织内血液，将大鼠体内血液置换干净(从右心房流出液体由血性转为清澈)，再用4%多聚甲醛固定液快速灌注100mL，再缓慢灌注100mL,直至鼠尾巴翘起，身体逐渐僵硬，颜色变白为止。灌注固定完成后，迅速断头取脑。轻轻打开颅腔，暴露出大鼠脑组织。用眼科剪轻轻将与脑组织相连的硬脑膜剥离，切断延髓取出右侧脑组织。弃去嗅球、小脑和低位脑干，取材范围包括梗死区及其周围的脑组织，用生理盐水冲洗，自额极至中脑间(距额极7-11mm)脑组织，入4℃4%多聚甲醛固定液中固定过夜，进行常规脱水、透明、石蜡包埋，连续冠状切片。
1.7 细胞凋亡检测(TUNEL法)
1.7.1 实验步骤 常规脱蜡至水，把石蜡切片依次放入： 二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min→无水乙醇Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ5min→90%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min→蒸馏水冲洗→滴3%H【sub】2【/sub】O【sub】2【/sub】室温10min→蒸馏水冲洗3次。取TBS1∶200新鲜稀释Proteinnasek 37℃，消化15min；TBS洗2min，3次。加标记缓冲液20ul/片(用TBS代替标记液作阴性对照)，按每张切片去TdT和DIG-d-UTP各1微升，加入18微升标记缓冲液中，混匀后加入，置湿盒中，37℃，标记2h。TBS皮潦草2min，3次。加封闭液50μL/片，室温放置30min，甩掉封闭液，不洗。用抗体稀释液1∶100稀释生物素抗地高辛抗体，混匀后50μL加至切片上，置湿盒中，37℃，30min；TBS 2min，3次。用抗体稀释液1∶100稀释SABC,混匀后50μL加至切片上，置湿盒中，37℃反应30min；TBS2min，3次。DAB显色，镜下观察，水洗。苏木素轻度复染，TBS洗，蒸馏水洗，脱水封片。
1.7.2 细胞凋亡切片图像结果分析方法 采用数码医学图像分析系统，光镜下可见细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性表达，即凋亡的细胞。每组选8张切片，利用显微摄像系统，取每张切片中梗塞灶边缘区域相互不重叠的4个视野(×200)按照像素分布摄入图像并保存于病理图像分析系统内，选择凋亡分析模块，通过灰度调节，区分视野内凋亡细胞个数，计算凋亡细胞数，取平均值进行统计学分析，见图1。
1.8 统计学方法
所有实验数据以均值土标准差(±s)表示，所得数据用SPSS 10.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 神经功能缺损评分结果
假手术组大鼠手术完成后，无神经缺损体征出现，模型组、眼针组于再灌注即刻出现明显神经功能缺损症状，证明模型制作成功。模型组、眼针组神经功能缺损症状经统计学处理(P>0.05)。再灌注3h，眼针组与模型组两组间比较无统计学意义(P>0.05)；再灌注24h，神经功能缺损最严重，模型组眼针组与模型组两组间比较有极显著差异(P<0.01)；再灌注72h，神经功能缺损仍较明显，眼针组与模型组比较差异极显著(P<0.05)，见表1。
表1 各组神经功能缺损评分均数比较(±s)
注：与模型组比较，＃P>0.05；﹡P<0.05；﹡﹡P<0.01。
2.2 细胞凋亡检测结果
假手术组各时间点仅见少量凋亡细胞。模型组及眼针组凋亡细胞于脑缺血再灌注3h凋亡细胞开始增多。凋亡细胞主要分布于缺血周边区，即缺血半暗带内，为圆形或椭圆形，核膜结构完整，核内染色质浓聚，染色质边集于核周，呈新月形、环行、长条形、块状小体甚至形成核碎片，核内可见棕褐色的TUNEL反应产物。模型组及眼针组各时间点凋亡细胞与假手术组相比均有显著性差异(P<0.01)，提示模型大鼠脑缺血半暗区存在细胞凋亡，细胞死亡以凋亡为主。随时间延长逐渐增多，于缺血再灌注24h凋亡细胞数达到高峰，缺血再灌注后72h凋亡细胞数较24h减少。3h时间点眼针组与模型组比较，经统计学处理无显著性差异(P>0.05)；24h、72h时间点眼针组与模型组比较凋亡细胞数明显减少，经统计学处理差异显著(P<0.01)，见表2。
图1 凋亡细胞表2 各组半暗区神经元凋亡数比较(±s)
注：与假手术组比较，＃P<0.01；与模型组比较，﹡P<0.01。
3 讨 论
眼针疗法是著名老中医彭静山教授于70年代首创，在眼眶周围用针刺等刺激防治疾病的一种微针疗法。其理论基础是眼通过经络系统与脏腑密切相连。根据眼针的取穴原则，针对中风的疾病基础是肝肾阴虚，取肝区、肾区滋补肝肾，上肢属上焦，下肢属下焦，因此取上焦区、下焦区通经活络，疏通上下肢经脉气血，使肢体经络气血通畅，经脉得养，半身不遂得以恢复。以往临床研究眼针治疗缺血性中风疗效肯定。以往研究提示眼针可激发脑细胞的功能活动，增加局部脑血流量【sup】[5]【/sup】。本研究通过动物实验从细胞凋亡途径探讨眼针治疗中风的机理。
神经功能缺损症状评分是评价缺血性脑损害最重要的终末指标之一，也是评价模型成功及脑组织功能恢复的有效方法。本实验除假手术组外，眼针组与模型组大鼠均于术后出现了神经功能缺损， 24h神经功能缺损最严重，分值最高，72h有所恢复，这说明大鼠脑缺血再灌注后在无治疗的情况下，自身存在神经功能恢复能力，但与眼针组比较，眼针组大鼠神经功能缺损症状明显恢复，24h、72h时间点与模型组比较均有显著性差异。这与眼针在临床上改善脑梗塞患者的肢体瘫痪程度，恢复肢体功能，相一致。
有效的抑制缺血后神经元凋亡是脑缺血治疗的关键。细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡,即程序性细胞死亡(PCD),具有主动性、选择性、可逆性的特点【sup】[2]【/sup】。脑缺血后治疗的关键就在于及时挽救缺血周边区即半暗带区内尚未死亡的神经元，因此如何有效的拮抗脑缺血后神经元凋亡，挽救半暗带是治疗缺血性脑血管病的关键。我们的实验显示模型组在脑缺血再灌注3h缺血周边区内凋亡神经元开始出现，随时间延长在脑缺血24h后凋亡神经元数达到高峰，以后逐渐减少。眼针组与模型组比较，眼针组凋亡神经元数目均明显少于模型组，说明眼针能有效抑制脑缺血再灌注后神经元凋亡作用。这一结论与李成勇等【sup】[6]【/sup】研究的结果大致相同。笔者认为可能是眼针通过抑制缺血半暗区细胞凋亡，改善局部缺血缺氧从而改善缺血半暗区微循环，对脑缺血再灌注损伤起保护作用。
参考文献
[1] Reed JC Jurgensmeier JM，Matsuyama S. Bcl-2 family proteins and mitochondrial [J] ......
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