大黄素抑制胰腺癌裸鼠原位移植瘤的实验研究(2)
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1.6 免疫组织化学法检测Ki-67 CD34和MMP-9,观察PI、MVD及MMP-9的表达
免疫组化采用EnVison法：取肿瘤组织切片，常规脱蜡、水化，微波处理后分别加稀释的Ki-67、CD34和MMP-9抗体为一抗，孵育60 min，再加二抗，孵育30 min，DAB显色，苏木精套染，透明，封片后待检。
在高倍镜(400×)随机选择20个视野，计算镜下Ki-67阳性细胞所占比例，即为细胞增殖指数(PI)；低倍镜(100×)下寻取血管密度最高的区域，然后高倍镜(400×)下随机选择20个视野，计数每个视野中CD34阳性细胞数，即为微血管密度(MVD)；在高倍镜(400×)随机选择20个视野，计算镜下MMP-9阳性细胞所占比例，定量MMP-9在胰腺癌中的表达。
1.7 数据的统计处理
应用SPSS 11.0统计软件进行方差分析和卡方检验，实验所得计量数据以均数±标准差(±s)的形式表示，P<0.05时为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 大黄素对裸鼠胰腺癌原位移植瘤生长的影响
实验中，对照组有一只裸鼠死于恶液质；实验组用药期间部分出现稀便，疗程结束后好转。处死模型裸鼠后分离胰腺肿瘤,称重。与对照组裸鼠瘤重(1.651±0.404)g相比，实验Ⅰ组瘤重(1.442±0.387)g降低无显著意义，抑瘤率仅为12.7%；实验Ⅱ组裸鼠瘤重(1.215±0.452)g明显降低(P< 0.05)，抑瘤率为26.4%。见表1。
表1 大黄素对体内胰腺癌生长和转移的影响
注：与对照组相比较，*P< 0.05。
表2 大黄素对裸鼠胰腺肿瘤中
PI MVD和MMP-9表达的影响
注：与对照组相比较，*P<0.05。
图1 免疫组织化学法检测大黄素对
裸鼠胰腺癌原位移植瘤中Ki-67、CD34和
MMP-9表达的影响(×400)
2.2 大黄素对裸鼠胰腺癌原位移植瘤转移的影响
模型尸检以及HE染色证实，对照组裸鼠胰腺肿瘤发生多发转移，转移部位多见于肠、肝、腹壁和肺；两实验组荷瘤裸鼠中，胰腺肿瘤转移明显被抑制(P< 0.05)，有转移者转移灶多局限于腹壁。见表1。
2.3 大黄素对裸鼠肿瘤组织Ki-67、CD34及MMP-9蛋白表达的影响
免疫组织化学染色可见对照组肿瘤组织中大量细胞Ki-67、CD34及MMP-9阳性表达；两实验组肿瘤组织中Ki-67、CD34及MMP-9阳性细胞均明显减少见图1，与对照组相比较，差异有统计学意义(P< 0.05)，见表2。
3 讨 论
胰腺癌是一种预后很差的消化道恶性肿瘤，即便作为治疗进展期胰腺癌首选化疗药物的吉西他滨，治疗的总有效率也小于20%，且无明显的抗转移作用【sup】[3-4]【/sup】。研究表明大黄素在体外可抑制多种恶性肿瘤细胞生长，但大黄素在体内对恶性肿瘤的生长、转移方面的研究却鲜有报道。因此，笔者通过建立裸鼠人胰腺癌外科原位移植模型(SOI)，观察不同剂量大黄素对胰腺癌裸鼠原位移植瘤生长和转移的影响并初步探讨其机制。
分析本研究结果可知，原位移植8周后，高剂量大黄素组裸鼠胰腺肿瘤的瘤重明显低于对照组，细胞增殖指数(PI)明显下降，且转移率亦有明显降低，有转移者转移部位也多局限于腹壁；低剂量大黄素虽未能显示明显抑制胰腺肿瘤的生长，但能显著抑制其转移，且PI值也有明显下降。故表明一定剂量的大黄素在裸鼠体内能显著抑制胰腺移植瘤的生长和转移。
新生血管形成是由一系列步骤组成的生物学过程，在机体伤口愈合、炎症反应和月经等生理过程中存在但被严格限制着。而在肿瘤侵袭和转移中，新生血管形成扮演着极为重要的角色，一旦肿瘤长到拥有诱导血管生长的能力，肿瘤生长就变得极富有侵犯性，从而为肿瘤侵袭和转移提供便利和可能【sup】[5]【/sup】。而通过抑制肿瘤血管生长、破坏肿瘤血供可抑制肿瘤生长和转移【sup】[6]【/sup】。既往多个研究表明，大黄素可抑制多种血管内皮细胞增殖及其功能，具有抑制血管生长的生物学效应【sup】[7,8]【/sup】。本研究中，我们通过微血管密度(MVD)来评价胰腺移植瘤中血管生成程度，结果表明，相对于对照组，实验组中胰腺肿瘤中MVD均有显著下降，表明了一定剂量的大黄素能够抑制胰腺肿瘤血管生长，与相关文献报道相符。因此，可以推断抑制血管生长在大黄素体内抑制胰腺移植瘤生长和转移中发挥了一定的作用。
肿瘤侵袭和转移是一个多因素、多步骤的生物学过程。在肿瘤转移过程中，金属蛋白酶(MMPs)家族在促进肿瘤细胞迁移、细胞外基质降解和肿瘤远处转移等生物学行为中过程中发挥了关键作用，尤其是MMP-9被认为不仅在降解细胞外基质蛋白中扮演着重要角色，而且MMP-9还可调控血管内皮生长因子(VEGF)，与肿瘤新生血管形成相关，从而在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用【sup】【/sup】[9,10]。因此，抑制MMP-9在肿瘤中表达可有效抑制肿瘤侵袭和转移。既往已有研究指出，大黄素可下调皮肤癌细胞中MMP-9的表达【sup】[11]【/sup】。而在本研究中，我们也观察到了一定剂量的大黄素能下调裸鼠胰腺癌原位移植瘤中MMP-9的表达。因此，可以认为在大黄素抑制胰腺肿瘤的转移和血管生长的过程中，抑制MMP-9的表达可能是其重要途径。
临床实践中，抗肿瘤血管生成药物sorafenib和sunitinib在用于治疗转移性肾癌中均已取得了满意的疗效【sup】【/sup】[12,13]，而本研究不仅表明大黄素在裸鼠体内的抗胰腺癌原位生长、转移作用，还在分子水平上表明大黄素可以抑制裸鼠胰腺肿瘤组织中CD34和MMP-9的表达，抑制肿瘤血管生长。因此，若加以进一步的研究，大黄素可望成为治疗胰腺癌新的化疗药物。
参考文献
[1] 徐贤绸，林胜璋 ......
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