未分化骨髓基质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖反应的初步研究(2)
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1.4 BMSCs抑制植物血凝素刺激淋巴细胞增殖反应 同样获取外周血淋巴细胞,细胞计数后以1×10【sup】5【/sup】细胞/孔接种于96孔板，加入PHA(Sigma公司，美国)，浓度为2μg/mL, BMSCs经PBS反复冲洗后，以1×10【sup】2～5【/sup】细胞/孔数量分别加入共培养5天。参照Chestnut【sup】[7]【/sup】方法，BMSCs离心收集后弃上清，加入0.5%多聚甲醛作用20 min使细胞失活，同样数量接种并与淋巴细胞共同培养，观察失活的BMSCs对淋巴细胞增殖的抑制情况，测CPM值。
1.5 BMSCs对双向混合淋巴细胞反应的作用 按上述方法收集外周血淋巴细胞，按照反应细胞(responding cells)、刺激细胞(stimulating cells)接种于96孔板，细胞数目均为1×10【sup】5【/sup】个。“第三者”(Third Party)BMSCs经PBS反复冲洗后，以1×10【sup】2～5【/sup】细胞/孔数量分别加入，与淋巴细胞共培养5天，同法加入【sup】3【/sup】H-TDR,测定CPM值。同材料与方法1.4中接种失活的BMSCs，观察其对淋巴细胞增殖的抑制情况。
1.6 Transwell培养 通透性隔离腔(transwell chamber)膜的孔径为0.3μm，能够有效隔离细胞间的相互接触，同时保证大分子物质能够在腔内外自由弥散。同样方法收集外周血淋巴细胞，反应细胞与刺激细胞接种于六孔板；隔离腔内接种BMSCs，浓度为10×10【sup】6【/sup】细胞/mL，将接种BMSCs的隔离腔放入六孔板内共培养5天，取出隔离腔，六孔板内淋巴细胞以5×10【sup】5【/sup】细胞/孔接种于96孔板，加入【sup】3【/sup】H-TDR,测定CPM值【sup】[8]【/sup】。
1.7 统计学处理 所有数据均以均数+标准差表示。应用单因素方差分析(one-way ANOVA)和t检验进行组间比较。
2 结 果
2.1 BMSCs单向刺激淋巴细胞增殖反应 为了观察异体BMSCs是否对淋巴细胞具有促增殖作用，体外淋巴细胞培养中加入1×10【sup】5【/sup】细胞/孔的异体BMSCs。作用5天后，与无外源性细胞组相比未见淋巴细胞出现明显增殖。异体成纤维细胞与异体淋巴细胞，加入体外培养的淋巴细胞中，淋巴细胞出现明显增殖。见表1。
表1 BMSCs对非特异性淋巴细胞反应的作用
注：BMSCs组与无外源性细胞组相比较，*P>0.05；BMSCs组分别与成纤维细胞组及异体淋巴细胞比较，#P<0.05。
2.2 BMSCs对非特异性淋巴细胞反应的作用 为了观察BMSCs是否对非特异性的淋巴细胞增殖反应具有抑制作用，本实验中以PHA刺激淋巴细胞增殖，发现1×10【sup】3～5【/sup】数量级的BMSCs可明显抑制淋巴细胞增殖(P<0.05)，抑制作用呈浓度依赖性，细胞浓度降低到1×10【sup】2【/sup】时，抑制作用基本消失(P>0.05)。BMSCs以0.5%多聚甲醛作用失活后，所有浓度的抑制作用均消失。见表2。
表2 BMSCs对PHA引起的非特异性淋巴细胞反应的作用
注：1×10【sup】3～5【/sup】数量级的BMSCs组与无外源性细胞组比较，*P<0.05；1×10【sup】2【/sup】数量级的BMSCs组及所有多聚甲醛固定组与无外源性细胞组比较，#P>0.05。
2.3 BMSCs对双向混合淋巴细胞反应的作用 为了观察BMSCs能否抑制异体淋巴细胞刺激导致的淋巴细胞增殖，在体外双向混合淋巴细胞培养中加入“第三者” BMSCs，BMSCs细胞数量分别为1×10【sup】2～5【/sup】个，共同培养5天后，发现1×10【sup】3～5【/sup】数量级的BMSCs使淋巴细胞的增殖得到明显抑制，随着BMSCs数量的减少至1×10【sup】2【/sup】时，抑制作用明显降低。BMSCs以0.5%多聚甲醛作用失活后，所有浓度的抑制作用均消失。见表3。
2.4 BMSCs的抑制作用为非接触依赖性 为了观察BMSCs对混合淋巴细胞反应的抑制作用，是否由于BMSCs与淋巴细胞接触所致，我们采用隔离腔培养法将BMSCs与淋
表3 BMSCs对双向混合淋巴细胞反应的作用
注：1×10【sup】3～5【/sup】数量级的BMSCs组与异体淋巴细胞比较，*P<0.05；1×10【sup】2【/sup】数量级的BMSCs组、所有多聚甲醛固定组及所有成纤维细胞组与异体淋巴细胞比较，#P>0.05。
巴细胞隔离培养，同时不阻断相互的大分子物质弥散。研究发现，BMSCs与淋巴细胞共培养5天后，隔离腔培养(Transwell组)与直接接触的BMSCs同样，能够显著抑制淋巴细胞增殖反应。见表4。
表4 隔离腔培养BMSCs对对双向混合淋巴细胞反应的作用
注：Transwell组与异体淋巴细胞组相比较，*P<0.05； Transwell组与BMSCs组比较，#P>0.05。
3 讨 论
成体干细胞的应用是近些年来国内外的研究热点之一， BMSCs的许多特性使其成为组织工程、细胞治疗、基因治疗中的重要种子细胞之一。基于干细胞移植方面的研究也表明干细胞具有特殊的免疫学特性，已有同种异体移植应用的报道【sup】[9]【/sup】。为了使用同种异体BMSCs进行细胞移植治疗，我们通过体外实验对BMSCs的免疫学特性进行初步的研究。
本研究进行了BMSCs对淋巴细胞反应调节作用的观察与检测。研究发现，单纯的犬BMSCs未能刺激异体淋巴细胞产生增殖反应，说明BMSCs具有较低的免疫原性，但其低免疫原性的原因尚不明确。1990年Horowitz等的研究显示，供体和受体之间的排斥反应主要取决于主要组织相容性复合体(MHC)分子的表达，理想的供体应和受体表达相同的MHC。国外学者对BMSCs的免疫学特性研究发现，人BMSCs不表达MHC-Ⅱ类分子，不表达或低表达MHC-Ⅰ类分子、CD40和CD40L,也不表达共刺激分子B7-1(CD80)和B7-2(CD86)【sup】【/sup】[4 ......
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