黄芪注射液对重症肺炎大鼠胸腺细胞凋亡相关蛋白表达的影响(2)
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参见附件(5176KB，7页)。
(2)重症肺炎模型制备 参考陈业民等【sup】[1]【/sup】的方法制作。实验动物在实验前12h禁食，自由饮水。大鼠50mg-100mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉后，颈部消毒、备皮无菌操作，暴露大鼠上段气管，用1mL注射器经气管滴入菌悬液。其中，模型组和黄芪各组滴入0.3mL菌悬液，对照组滴入0.3mL生理盐水。接种后立即竖立大鼠固定台，使大鼠保持直立位约20min，以保证接种菌液因重力作用而入肺，并左右旋转体位，使菌液均匀分布于两肺。造模第六天取大鼠部分肺组织，做肺组织匀浆菌落计数和石蜡切片HE染色，光镜观察病理变化，证实重症肺炎模型的建立。
(3)动物分组和用药 SD雄性大鼠40只，随机分为5组，分别为对照组、模型组、黄芪高剂量组、黄芪中剂量组和黄芪低剂量组，每组均为8只。除对照组外各组均采用气管穿刺注入感染法制作大鼠重症肺炎模型,对照组气管穿刺注入法滴入0.3mL生理盐水。黄芪高、中、低剂量组分别予10mL/kg、5mL/kg和2.5mL/kg的黄芪注射液稀释至2.5mL腹腔注射，对照组和模型组予2.5mL生理盐水腹腔注射。
(4)取材和指标检测 于造模后的第6天氯胺酮50-100mg/kg麻醉后,开胸取全肺，取右肺部分用10% 甲醛溶液固定24h后，石蜡包埋切片，一部分HE染色，光镜观察；一部分TUNEL法观察胸腺细胞凋亡，染色步骤分别按照TUNEL试剂盒说明书进行；凋亡细胞计数:细胞核中出现棕色颗粒为TUNEL 阳性细胞,即凋亡细胞,选择阳性细胞区, 400倍目镜下分别计数D16目镜测微网网格中阳性细胞数和细胞总数,每例计数10网格,重复3次,取平均值，计算凋亡指数(apoptosis index，AI)，AITUNEL阳性细胞数/细胞总数×100% 。取右肺部分肺组织匀浆细菌培养,计数菌落并鉴定菌属, 观察细菌清除情况, 细菌培养结果以>10【sup】3【/sup】CFU/uL 为阳性。取右肺部分组织液氮保存Western blot检测胸腺细胞cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax表达。支气管肺泡灌洗液(bronchialveolar lavage fluid, BALF)白细胞和中性粒细胞计数:左肺以2mL无菌生理盐水注入气管，轻轻按摩左肺30s抽回灌注液体，再灌注该液体，反复抽注3次，最后将灌入的液体抽出为1次灌洗完毕。同法操作共3次。将全部灌洗液收集一起，测总容量，回收支气管肺泡灌洗液BALF(回收率>50%)，用双层干纱布过滤后于1500r/min离心15min，去上清液后的沉淀部分做白细胞和中性粒细胞计数。
Western-blot：碾钵经消毒后，加入少量液氮，将冻存于-80℃的小块组织迅速转移至置于其中，快速用碾棒把组织块碾磨成细粉末状后立即转移入事先盛有RIPA缓冲液的1.5mL离心管中。反复冻融裂解后，13000r/min离心30min，取上清液定量，上述操作均在4℃状态下进行。80μg蛋白上样至12%SDS聚丙烯酰胺胶上，根据分子量的大小蛋白经电泳分布到胶上，通过Bio-Rad的湿转膜系统将蛋白从胶上转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，PVDF膜经5%牛奶常温下封闭1h后，结合一抗4℃旋转过夜，二抗结合1h后经增强的化学发光系统检测。最后应用Image-pro5.2软件进行半定量分析。每组重复3次。
1.3 统计学处理 所得计量资料以均数±标准差(±s) 表示,采用SPSS 11.5统计软件进行数据结果分析。计量资料采用t检验及单因素方差分析,组间比较采用S-N-Kq检验。
2 结 果
2.1 肺组织病理改变及肺组织匀浆菌落计数 光镜观察对照组肺组织形态大致正常,模型组和黄芪各组可见各级支气管周围大量白细胞、中性粒细胞浸润, 同时可见肺组织广泛实变、水肿且伴出血, 肺泡壁广泛受到破坏。菌株在大鼠体内生长后，经肺组织匀浆菌落培养，菌落计数均>10【sup】3【/sup】CFU/L，做微生物菌种鉴定后均为原菌株。
2.2 各组BALF白细胞和中性粒细胞计数比较 模型组和黄芪各组BALF白细胞和中性粒细胞计数均高于对照组(P<0.05),模型组和黄芪各组之间白细胞和中性粒细胞计数无显著性差异(P>0.05)。见表1。
表1 各组BALF白细胞和中性粒细胞计数的比较
(×10【sup】9【/sup】/L，±s)
注：与对照组比较，*P<0.05。
2.3 各组大鼠胸腺细胞凋亡观察 TUNEL法染色显示对照组细胞数量较密集,凋亡细胞较少。模型组可见较多的凋亡细胞。黄芪各剂量组均见一定量的凋亡细胞。模型组与黄芪各组凋亡指数均高于对照组(P<0.05)。与模型组比较,黄芪高剂量组胸腺细胞凋亡指数降低( P<0.05),而黄芪中、低剂量组与模型组比较胸腺细胞凋亡指数无显著性差异(P>0.05)。见表2。
表2 各组大鼠胸腺细胞凋亡指数的比较(%, ±s)
注：与对照组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05。
2.4 各组大鼠胸腺细胞cleaved caspase-3 Bcl-2 Bax表达和Bcl-2/Bax比值的比较 与对照组相比,模型组及黄芪各组大鼠胸腺细胞cleaved caspase-3和Bax表达水平均显著升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值均显著降低(P<0.05)，除黄芪高剂量组外Bcl-2表达水平均显著降低(P<0.05)，黄芪高剂量组Bcl-2表达水平与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。黄芪高剂量组大鼠胸腺细胞cleaved caspase-3和Bax表达水平低于模型组(P<0.05)，Bcl-2表达水平和Bcl-2/Bax比值均高于模型组(P<0.05)，而中、低剂量组与模型组比较均无显著性差异(P>0.05)。见表3，图1、图2。
表3 各组大鼠胸腺细胞cleaved caspase-3 Bcl-2
Bax表达和Bcl-2/Bax比值的比较(±s)
注：对照组的比值设定为1，其他四组的比值是除以对照组后的相对比值 *与对照组相比较，P<0.05，#与模型组相比较，P<0.05。
图1 各组大鼠胸腺细胞Cleaved Caspase-3的表达 ......
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