荷叶水提物抑制氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞表达单核细胞趋化蛋白1和血管细胞黏附分子(2)
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氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)是动脉粥样硬化最明确的危险因子之一，Ox-LDL可能通过诱导内皮细胞表达黏附分子和趋化因子，募集单核细胞向血管内皮黏附，从而在动脉粥样硬化的发生中起重要作用。荷叶为睡莲科植物莲的叶，又名藕叶，种植于我国南方大部分省份，荷叶药、食两用，既往研究表明，荷叶中的生物活性物质具有降脂、减肥、降血压等多种作用【sup】[1-4]【/sup】。本研究旨在探讨荷叶水提物能否抑制Ox-LDL诱导的血管内皮细胞表达趋化因子和黏附分子。
1 材料与方法
荷叶水提物(由湘南学院关章顺教授提供)，提取方法按文献【sup】[11]【/sup】，人脐静脉内皮细胞[ATCC, USA.(CRL-1730)]，新生小牛血清(中南大学湘雅中心实验室)，RPMI 1640培养基(GIBCO)，Ox-LDL(北京协和三友公司)，Trizol(Molecular Research Center, Inc)，RevertAid【sup】TM【/sup】 First strand Cdna Synthesis Kit(Fermentas)，台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)，TaKaRa Taq【sup】TM【/sup】 Hot start version[宝生物工程(大连)有限公司]，DNA Ladder Marker[宝生物工程(大连)有限公司]，引物设计与合成(北京奥科生物技术有限责任公司)，MCP-1和VCAM-I ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)
1.1 人脐静脉内皮细胞的培养 人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs)用含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基(含10mmol/L的HEPES，2mmol/L谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，10%小牛血清)，37℃、5%CO【sub】2【/sub】培养箱中培养，隔天换液，生长至85%融合时接种于6孔板，接种密度为1×10【sup】6【/sup】/孔。台盼蓝染色检测细胞活力大于90%。待细胞贴壁生长占孔板底面积约50%满后，随机分组用于实验，每组重复3孔。
1.2 Ox-LDL刺激和药物干预实验 Ox-LDL刺激组为细胞中分别加入25mg/L、50mg/L、100mg/L的Ox-LDL，共同孵育24h，药物干预组则分别在细胞中加入10mg/L、20mg/L、40mg/L的荷叶水提物(用含DMSO的无血清培养基配制，DMSO含量<1‰)共同孵育24h，去上清，分别再加50mg/L的Ox-LDL刺激24h，收集细胞用于提取总RNA，空白对照组细胞中除不加Ox-LDL和药物外其余条件同刺激组。
1.3 半定量RT-PCR方法检测细胞的单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)的mRNA的表达：收集细胞，用Trizol提取细胞总RNA，经紫外分光光度仪(Beckman DU-640)测定OD 260/280比值在1.8-2.0，半定量RT-PCR检测MCP-1和VCAM-1的mRNA表达，RT-PCR操作按试剂盒说明书进行。RT反应条件：70℃ 5min，25℃ 5min，25℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min。人MCP-1引物：上游引物5’-CAT AGC AGC CAC CTT CAT TCC-3’，下游引物：5’-GAG TTT GGG TTT GCT TGT CCA-3’，PCR扩增片段长254 bp。人VCAM-1引物序列：上游：5’-TCT ACG CTG ACA ATG AAT CC-3’，下游：5’-ACT TGA CTG TGA TCG GCT TC-3’，扩增长度178bp；GAPDH引物序列：上游：5’-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3’，下游：5’-ATGGACTGTGGTCATGAGTCCTTC-3’，扩增长度521bp。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。MCP-1反应条件：94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸60秒，30个循环；最后72℃延伸7min。VCAM-1反应条件：94℃ 5min,(94℃ 40s，59℃ 40s，72℃ 40s)30个循环，然后72℃ 5min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，以MCP-1和VCAM-1扩增条带的吸光度值(A value)与GAPDH条带的吸光度之比作为MCP-1和VCAM-1 mRNA的表达量。
1.4 酶联免疫吸附法(Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay，ELISA)测定细胞上清MCP-1和VCAM-1含量 采用酶联免疫吸附法测定细胞上清中MCP-1和VCAM-1的蛋白水平，检测灵敏度为15.6-1000pg/mL,操作步骤严格按照试剂盒及酶标仪的说明书进行。批内批间变异系数均控制<1%，且每份样品设复孔6个。将所有的标准品和样品的OD值减去0孔的OD值，以OD值为纵坐标，以浓度为横坐标，画出标准曲线，根据样品的OD值在标准曲线上读出对应的浓度。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS 13.0统计软件分析，多个样本均数比较用One-Way ANOVA，两两比较用LSD法，P<0.05有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同浓度Ox-LDL刺激后HUVECs的MCP-1 mRNA和VCAM-1 mRNA的表达及细胞上清MCP-1和VCAM-1含量变化
如图1、2、3所示，分别用25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L的Ox-LDL刺激HUVECs后 ......
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