中药复方治疗早期糖尿病肾病的实验研究(1)
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摘 要：目的：观察中药复方对糖尿病大鼠肾皮质TGF-β1、Ⅳ型胶原基因表达等指标的影响，探讨该复方防治早期糖尿病肾病的作用机制。方法：Wistar雄性大鼠采用链脲佐菌素(STZ)，造成糖尿病模型，随机分为正常组、模型组、西药对照组、中药治疗组4组，用药干预8周后，观察24h尿微量白蛋白(Ualb)、肾皮质转化生长因子β1mRNA表达、肾皮质Ⅳ型胶原mRNA表达及各组肾组织形态学改变情况。结果：模型组肾皮质转化生长因子β1mRNA表达、肾皮质Ⅳ型胶原mRNA表达均明显升高；中药组肾皮质TGF-β1mRNA、Ⅳ型胶原mRNA表达与模型组比较均有所下降；电镜观察结果显示：肾小球基底膜增厚及足突融合显著减轻。结论：中药复方可能通过抑制糖尿病大鼠肾皮质TGF-β1mRNA与Ⅳ型胶原mRNA表达而实现其对糖尿病大鼠肾脏病变的保护作用。
关键词：中药复方；糖尿病肾病；肾皮质TGF-β1mRNA；肾皮质Ⅳ型胶原
中图分类号：R781.64文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2011)04-0802-03
糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)最严重和最常见的慢性并发症之一，系由糖尿病性微血管病变所致，并成为终末期肾衰(ESRD)的重要原因，也是糖尿病的主要死亡原因之一。
在DN慢性肾脏损害逐渐发展的过程中，有许多重要的细胞因子参与病变过程，并处于关键的地位。TGF-β1已被公认导致细胞外基质(ECM)积聚的重要生长因子，其表达过多，并由此介导的ECM成分积聚是DN发生的关键因素。本实验通过观察中药复方对DM大鼠肾皮质Ⅳ型胶原、TGF-β1mRNA表达的影响，来探讨其对DN病变的保护作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
Wistar雄性大鼠51只，体重(220±20)g，清洁级，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.2 药物
依那普利片：江苏制药股份有限公司，每片10mg，批号：08071502；中药饮片：购于辽宁中医药大学附属第二医院药局，按传统方法煎煮，滤液浓缩，每毫升含生药15g。
1.3 试剂
链脲佐菌素(STZ)：美国Sigma公司；白蛋白放射免疫分析试剂盒：北京北方生物技术研究所；Trizol提取试剂盒:invitrogen公司生产，批号：1203405；DEPC：宝生物工程(大连)有限公司，批号：BBI0916S03；DNA—marker DL2000：宝生物工程(大连)有限公司，批号：CB3301；Rt-pcr试剂盒：宝生物工程(大连)有限公司，批号：Bk2701 RT-PCR试剂盒：大连宝生物有限公司；琼脂糖、溴化乙锭(EB)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)：美国Sigma公司产品；TGF-β1引物、Ⅳ型胶原引物：由北京六合华大基因科技股份有限公司提供。
1.4 主要仪器
血糖仪：台湾Rightest【sup】TM【/sup】GM300电子感应微量血糖仪； PE9600型PCR仪：美国PERKIN ELMER出品；EPS-300型恒压恒流电泳仪：上海天能公司；DYCP-33A型电泳槽：北京六一仪器厂；上海天能UV-2000型凝胶成像系统；RXdaytona型全自动生化分析仪：英国朗道公司。
2 实验方法
2.1 动物模型的建立及分组
清洁级Wistar雄性大鼠51只，体重(220±20)g，按体重层次随机抽取9只为正常对照组，余下42只(分3组)为造模组。用0.1mmol/L无菌枸橼酸缓冲液(PH4.2，4℃)，配成2%的STZ溶液，大鼠禁食10h后按53mg/kg腹腔注射，72h后测定血糖≥16.7mmol/l者列入观察对象，造模过程中大鼠全部成模。将造模成功大鼠，按血糖层次再随机分为模型组(14只)、西药组(14只)、中药组(14只)。正常对照组注射等量无菌枸橼酸缓冲液。
2.2用药方法
按人和动物体表面积折算的等效剂量比值表，计算出大鼠的等效剂量。造模成功后按等效剂量，中药组予中药煎剂15g·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】灌胃，西药组予依那普利片1mg·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】灌胃，正常对照组和单纯DM模型组予自来水10mL·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】灌胃。每日1次灌胃，时间8周。
2.3 标本采集 尿液：给药4周及8周末，用代谢笼分别留取每只大鼠24h尿液，记录尿量，取出2mL，用于UAlb测定；血液:于第8周末，腹腔注射20%乌拉坦(按0.4mL/100g给药)麻醉大鼠，腹主动脉取血2mL放入普通试管，并立即送检测定血清Cr、BUN；肾皮质：给药第8周末，腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠(同上)，摘取左肾称重后取肾皮质组织块放入10%中性福尔马林中固定，用于组织学检测标本制作；摘取右肾称重后于冰上取肾皮质，迅速置于DEPC水处理并高压灭菌的Ep管中，-70℃冰箱保存待测分子生物学指标。
2.4 检测指标
2.4.1 血糖 于用药前及用药8周末断尾取血，用微量血糖仪测定血糖。
2.4.2 肾功能 全自动生化分析仪检测血清Cr、BUN。
2.4.3 尿微量白蛋白 采用放射免疫法,严格按照试剂盒说明书操作。
2.4.4 分子生物学指标检测 RNA甲醛变性凝胶电泳：铺制甲醛凝胶，琼脂糖300mg，甲醛电泳液25mL，用酒精灯加热熔化，待冷却至60℃时加入EB 3μL，混匀后灌制凝胶。待胶凝固后移入含甲醛电泳液的电泳槽中。将所提取的RNA 5μL加入适量上样缓冲液混匀后用移液枪将样品加入样品孔中。接通电泳槽与电泳仪的电源，电泳1h，将胶置于紫外线透射仪上观察结果，并拍照留做记录。逆转录：按照宝生物工程(大连)有限公司的cDNA合成试剂盒进行。PCR产物分析：配制2%的琼脂糖凝胶，取PCR产物5μL，加12μL上样缓冲液，上样于琼脂糖凝胶中，以5V/CM凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TAE。当溴酚蓝电泳至凝胶全长的2/3后，停止电泳 ......
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