补肾丹对衰老模型大鼠脑海马组织P53基因表达的影响(1)
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摘 要：目的：观察补肾丹对衰老模型大鼠脑海马组织P53基因表达的影响。方法：将清洁级健康Wistar雄性大鼠，随机分为7组：正常对照组、金匮肾气丸组、补肾丹高、中、低剂量组、维生素E组、模型组。除正常对照组外各组腹腔注射D-gal(250mg·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】)60天，采用D-半乳糖致亚急性衰老法【sup】[1]【/sup】，造成大鼠拟衰老动物模型。同时，正常对照组和模型对照组给等体积的生理盐水，金匮肾气丸组同时给予金匮肾气丸(0.72g·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】)灌胃，补肾丹高、中、低剂量组同时分别给予相当于生药2.7g·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】、1.35g·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】、0.675g·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】灌胃。维生素E组每日灌服维生素E0.027g/kg，每日1次，共60天。用RT-PCR法和Western-blot法对衰老模型大鼠脑海马组织P53基因表达水平进行检测。结果：补肾丹高、中、低剂量组可抑制凋亡相关基因——P53基因的过度表达，与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。结论：补肾丹能够抑制P53基因的过度表达，这有可能是其延缓衰老的作用机制之一。
关键词：补肾丹；P53基因；RT-PCR；Western-blot
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2011)04-0899-02
收稿日期：2010-11-17
作者简介：汪淼(1979-)女，助理研究员，博士，研究方向：中医基础理论。
通讯作者：谢宁(1957-)，男，湖北潜江人，教授，博士研究生导师，研究方向：中医基础理论。
随着老龄化国家增多，老龄人口的比率加大，人口的老龄化将成为一个社会问题。据联合国统计，至2000年全世界65岁以上的老人达到5.78亿。因此， 如何提高老年人的生活质量，成为近年来医学研究的热门课题。“补肾丹”的拟订是以民间验方为基础，结合历代著名医家治疗肾虚证的经验和大量的文献资料所创制的。本实验观察了补肾丹对衰老模型大鼠脑海马组织P53基因表达的影响，并与金匮肾气丸组及维生素E组比较,结果提示补肾丹能够抑制P53基因的过度表达。现将实验结果报道如下。
1 实验材料
动物：清洁级Wistar大鼠，雄性，体重(200±20)g。
药物：补肾丹由熟地、山药、山茱萸、枸杞子、等十四味组成，黑龙江省中西医结合研究所制剂室提供。金匮肾气丸：哈尔滨世一堂制药厂生产。维生素E:大连南美制药有限公司，国药准字:H210211947。购自人民同泰大药房。福临门大豆油(一级):北海粮油工业(天津)有限公司制造。D- gal：上海华舜生物工程有限公司(批号707222)。
饲料：普通饲料由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
2 方 法
分组与给药：将清洁级健康Wistar雄性大鼠，随机分为7组：正常对照组、金匮肾气丸组、补肾丹高、中、低剂量组、维生素E组、模型组。除正常对照组外各组腹腔注射D-gal(250mg·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】)60天，采用D-半乳糖致亚急性衰老法【sup】[1]【/sup】,造成大鼠拟衰老动物模型。同时，正常对照组和模型对照组给等体积的生理盐水，金匮肾气丸组同时给予金匮肾气丸(0.72g/ kg·d)灌胃，补肾丹高、中、低剂量组同时分别给予相当于生药2.7g·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】、1.35g·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】、0.675g·kg【sup】-1【/sup】·d【sup】-1【/sup】灌胃。维生素E组每日灌服维生素E0.027g/kg，每日1次，共60天。
3 结 果
3.1 RT-PCR法检测补肾丹对衰老模型大鼠P53基因表达的影响 见表1，图1。
表1 补肾丹对衰老模型大鼠P53基因表达的影响(±s)
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与正常对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01。
RT-PCR法检测结果提示，D-gal可诱发大鼠海马区域P53mRNA表达增加(P<0.01)。与模型组比较，补肾丹、对照药均可不同程度降低大鼠海马区域P53mRNA的表达(P<0.01)，并呈一定的剂量依赖性。其中补肾丹中剂量组下调幅度最大(表1)。电泳强度比较显示：模型组>补肾丹低剂量组>补肾丹高剂量组>金匮肾气丸组>维生素E组>补肾丹中剂量组>正常对照组。P53基因产物扩增片断分别为457bp和272 bp，与理论设计相符。
3.2 Western-blot法检测补肾丹对衰老模型大鼠P53基因表达的影响 见表2图2。
表2 Western-blot法检测补肾丹对衰
老模型大鼠P53基因表达的影响(±s)
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与正常对照组比较，△P<0.05 ，△△P<0.01。
P53与内参蛋白β-actin的western-blot的灰度比(GSR)能反映出P53蛋白的表达水平。其计算方法为：测得的目的蛋白的强度×面积/内参蛋白β-actin的强度×面积。因此密度灰度比越大，P53的表达水平就越高。模型组P53的GSR显著增高，与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较，其他各治疗组的GSR均有所降低(P<0.05)。补肾丹各剂量组中，中剂量组效果最好。
图2 补肾丹对衰老模型大鼠P53基因表达图谱
4 讨 论
细胞凋亡，又称细胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其它细胞吞噬【sup】[2]【/sup】，是一种受基因控制的生理性细胞死亡。但过量自由基会刺激细胞凋亡，进而引起机体的衰老【sup】[3]【/sup】。
凋亡是细胞内在的决定动物发育和组织平衡的一个重要机制。这个受到严密调控的细胞自杀机制一旦出现功能障碍或失去控制，将导致机体产生肿瘤、神经退行性疾病或其他病理性变化。机体内多种因素参与了细胞凋亡，机体的生长、发育及衰老均与细胞凋亡密切相关。由于衰老生物体在生命过程中随时间推移发生形态、结构、生理功能等方面一系列慢性、退行性变化，因此认为细胞的程序对衰老起主动作用，并引起特征性形态改变及衰老性生长停滞 ......
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