升清降糖合剂对氧化损伤胰岛β细胞Bcl-2\Bax\Akt表达的影响(2)
1.2.2 原代胰岛细胞分离、培养\[4\] 取成年SD大鼠200～250g，腹腔麻醉，经胆总管注入胶原酶溶液(1mg·mL-1)，消化，震荡，离心，过筛，Histopaque-1077纯化，收集胰岛，鉴定胰岛纯度达85%以上，活率达90%以上，显微镜下计数后以20个胰岛/孔加入24孔细胞培养板，以全培养基于37℃、5% CO2培养箱培养，胰岛悬浮生长，48h后分组干预。
1.2.3 RINm5F细胞的培养与传代 细胞复苏后以5×105/瓶接种于25cm2细胞培养瓶，以全培养基在37℃、5% CO2培养箱培养，3天传代一次，以5×105/孔细胞直接加入6孔板里或加入事先放有无菌盖玻片的6孔板里，48h后细胞均匀贴壁生长于培养板(或玻片)上，分组干预。
1.2.4 实验分组 本课题组前期实验通过MTT法检测RINm5F增殖率，确定0.2mmol·L-1干预24h为H2O2诱导胰岛β细胞氧化损伤模型的浓度和时间，确定10μg·mL-1为SQ最佳保护浓度\[3\]。故模型组加入0.2mmol·L-1 H2O2，保护组加入10μg·mL-1 SQ及0.2mmol·L-1 H2O2，正常组加入等量D-PBS，分别干预24h。
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1.2.5 Hoechst33342/PI流式检测细胞凋亡率 培养结束时以0.25%胰酶小心消化每孔细胞收集至1.5mL离心管，按凯基试剂盒内操作步骤进行，流式细胞仪分析。
1.2.6 Bcl-2/Bax免疫荧光 培养结束时去培养液，固定，洗涤，一抗孵育过夜，洗涤，二抗孵育，洗涤，封片后即至荧光显微镜630nm波长处下观察。Quantity One软件测量荧光度进行Bcl-2、Bax蛋白的半定量分析。
1.2.7 免疫印迹法检测RINm5F和原代大鼠胰岛磷酸化Akt的表达 收集各组细胞，每组不少于3×106细胞(RINm5F)或不少于20个原代大鼠胰岛，裂解，破膜，离心，取上清液，测样品蛋白浓度，加热变性，上样，电泳，转膜，封闭，一抗过夜，二抗孵育，洗涤，显色，显影，定影。洗脱，加内参，步骤同前。Quantity One软件测量条带的灰度进行磷酸化Akt的半定量分析。
1.2.8 统计学方法 计量资料以均数±标准差(±s)表示，均数间比较采用单因素方差分析，方差齐者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane,T2检验，检验水准为P<0.05。
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2 结 果
2.1 SQ减少氧化损伤RINm5F细胞凋亡率的凋亡率
经Hoechst/PI流式检测见表1，模型组凋亡率最高，少许坏死；正常组细胞存活率最高，其凋亡率和坏死率最低，与模型组比较，各相均有统计学差异(P<0.01)；保护组存活率升高，与模型组比较，P<0.01，其凋亡率和坏死率下降，与模型组有统计学差异(P<0.01)。
2.2 SQ抑制H2O2所致的RINm5F细胞Bcl-2表达减少和Bax表达增加
正常组的Bcl-2和Bax蛋白表达很少，荧光最弱，模型组以胞浆中Bax蛋白增加明显，与正常组比较，P<0.05；保护组在胞浆和核模上见Bcl-2蛋白显著增强，Bax蛋白表达减弱，二者分别与模型组比较，均呈P<0.05，见插页Ⅵ图1、表2。
, http://www.100md.com 2.3 SQ促进氧化损伤RINm5F和原代大鼠胰岛的Akt磷酸化
Western blot检测磷酸化Akt蛋白表达，分析显示见表3，对于RINm5F，模型组的磷酸化Akt减少，与正常组比较有差异(P<0.05)，保护组磷酸化Akt增强，与模型组比较有统计学差异(P<0.01)，对于原代大鼠胰岛，模型组的磷酸化Akt减少，与正常组比较有差异(P<0.05)，保护组磷酸化Akt增强，与模型组比较有统计学差异(P<0.05)。见插页Ⅵ图2。
表3 SQ对氧化损伤RINm5F和原代大鼠胰岛
磷酸化Akt蛋白表达的影响(n=3，±s)
3 讨 论
中医糖尿病认为中焦脾胃受损，不能运化水谷为精气，脾胃升清受损，久之则气津两伤而为消渴。升清降糖合剂(SQ)在治疗上效法李东垣“健脾升阳”法，是根据中医升阳理论基础上发展的具有益气滋阴、升清降糖作用的临床经验方，治疗2型和1型糖尿病为主，可改善其临床证候，稳定血糖水平，降低糖化血红蛋白，调节血脂\[1\]。实验研究证明，H2O2干预24h可诱导体外胰岛细胞凋亡，升清降糖合剂明显提高氧化损伤胰岛细胞瘤株RINm5F细胞活性，其作用机制与提高SOD/MDA比例有关\[3\]。
, 百拇医药
氧化应激引起的功能损伤和细胞凋亡是1型糖尿病与2型糖尿病的发病和病程进展的共同机制，与线粒体及细胞凋亡途径密切相关。本实验中，流式细胞术检测保护组细胞凋亡率下降，可见一定浓度SQ具有抗氧化作用，减少胰岛细胞凋亡，保护其活性。
Bcl-2 蛋白家族成员在凋亡信号前期调节线粒体应答\[5\]，阻止线粒体蛋白如细胞色素C的释放，避免随之而来Caspase-9和Caspase-3的活化执行凋亡\[6\]。凋亡抑制蛋白Bcl-2的过表达可阻止细胞因子诱导的RINm5F细胞线粒体膜电位的破坏\[7\]。本实验通过免疫荧光激光共聚焦观察了RINm5F氧化损伤下Bcl-2和Bax蛋白表达，发现其表达在细胞浆中，模型组Bax较正常组明显增加，说明氧化损伤可增加凋亡诱导蛋白Bax的表达；而保护组Bcl-2较模型组明显增加，Bax减少，说明SQ可促进凋亡抑制蛋白Bcl-2，降低凋亡诱导蛋白Bax的表达，SQ的抗凋亡作用与调节凋亡相关蛋白有关。
Akt又称蛋白激酶B，在细胞存活和凋亡中起重要作用。胰岛素等生长和存活因子都可以激活Akt信号途径，Akt的Ser473可以被PDK1磷酸化，PI3 Kinase-Akt信号途径是一条经典的信号途径。Akt信号对糖尿病的胰岛素敏感性起关键作用。Akt还被证实在阻止迟发的细胞凋亡损伤和早期凋亡信号传导中作为一个关键调节者\[8，9\]。糖尿病造成包括神经和血管病变在内的的病理改变与氧化应激途径密切相关，胰岛素抵抗的氧化通路，包括活性氧族、线粒体通路、非耦联蛋白和内质网应激，这些通路最终连接到蛋白激酶B(Akt)，启动葡萄糖失耐受的内在因素——胰岛素通路，随后可致细胞凋亡损伤。本实验中，我们检测磷酸化Akt的表达，在RINm5F和原代大鼠胰岛中，模型组磷酸化Akt表达较正常组下降，可见H2O2可抑制Akt的磷酸化，引起细胞凋亡，而保护组磷酸化Akt较模型组上升，提示SQ可活化H2O2氧化损伤下PI3K通路中Akt使其磷酸化。值得注意的是，PI3K-Akt是糖代谢的主要通路之一，提示SQ有可能通过Akt通路参与调节糖代谢。
在本实验中，一定浓度H2O2可诱导胰岛细胞氧化损伤模型，流式细胞术提示细胞主要以凋亡改变，少数出现坏死，与糖尿病的病理改变基本相符。SQ通过促进凋亡相关蛋白Bcl-2的表达，抑制Bax蛋白表达，活化Akt途径达到抗氧化、抗凋亡的作用。
参考文献
[1] 倪小芬,胡臻,游欢庆,等.升清降糖合剂治疗糖尿病45例观察\[J\]. 新中医,2009,41(2):28-30.
\[2\] 霍丹群,刘佳,张伟,侯长军,谢果,张文.正交实验优选葛根复方的半仿生提取工艺\[J\].中成药,2004,(2):96-99., 百拇医药(倪小芬 胡臻 郑超 徐晓峰)
1.2.3 RINm5F细胞的培养与传代 细胞复苏后以5×105/瓶接种于25cm2细胞培养瓶，以全培养基在37℃、5% CO2培养箱培养，3天传代一次，以5×105/孔细胞直接加入6孔板里或加入事先放有无菌盖玻片的6孔板里，48h后细胞均匀贴壁生长于培养板(或玻片)上，分组干预。
1.2.4 实验分组 本课题组前期实验通过MTT法检测RINm5F增殖率，确定0.2mmol·L-1干预24h为H2O2诱导胰岛β细胞氧化损伤模型的浓度和时间，确定10μg·mL-1为SQ最佳保护浓度\[3\]。故模型组加入0.2mmol·L-1 H2O2，保护组加入10μg·mL-1 SQ及0.2mmol·L-1 H2O2，正常组加入等量D-PBS，分别干预24h。
, http://www.100md.com
1.2.5 Hoechst33342/PI流式检测细胞凋亡率 培养结束时以0.25%胰酶小心消化每孔细胞收集至1.5mL离心管，按凯基试剂盒内操作步骤进行，流式细胞仪分析。
1.2.6 Bcl-2/Bax免疫荧光 培养结束时去培养液，固定，洗涤，一抗孵育过夜，洗涤，二抗孵育，洗涤，封片后即至荧光显微镜630nm波长处下观察。Quantity One软件测量荧光度进行Bcl-2、Bax蛋白的半定量分析。
1.2.7 免疫印迹法检测RINm5F和原代大鼠胰岛磷酸化Akt的表达 收集各组细胞，每组不少于3×106细胞(RINm5F)或不少于20个原代大鼠胰岛，裂解，破膜，离心，取上清液，测样品蛋白浓度，加热变性，上样，电泳，转膜，封闭，一抗过夜，二抗孵育，洗涤，显色，显影，定影。洗脱，加内参，步骤同前。Quantity One软件测量条带的灰度进行磷酸化Akt的半定量分析。
1.2.8 统计学方法 计量资料以均数±标准差(±s)表示，均数间比较采用单因素方差分析，方差齐者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐者用Tamhane,T2检验，检验水准为P<0.05。
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2 结 果
2.1 SQ减少氧化损伤RINm5F细胞凋亡率的凋亡率
经Hoechst/PI流式检测见表1，模型组凋亡率最高，少许坏死；正常组细胞存活率最高，其凋亡率和坏死率最低，与模型组比较，各相均有统计学差异(P<0.01)；保护组存活率升高，与模型组比较，P<0.01，其凋亡率和坏死率下降，与模型组有统计学差异(P<0.01)。
2.2 SQ抑制H2O2所致的RINm5F细胞Bcl-2表达减少和Bax表达增加
正常组的Bcl-2和Bax蛋白表达很少，荧光最弱，模型组以胞浆中Bax蛋白增加明显，与正常组比较，P<0.05；保护组在胞浆和核模上见Bcl-2蛋白显著增强，Bax蛋白表达减弱，二者分别与模型组比较，均呈P<0.05，见插页Ⅵ图1、表2。
, http://www.100md.com 2.3 SQ促进氧化损伤RINm5F和原代大鼠胰岛的Akt磷酸化
Western blot检测磷酸化Akt蛋白表达，分析显示见表3，对于RINm5F，模型组的磷酸化Akt减少，与正常组比较有差异(P<0.05)，保护组磷酸化Akt增强，与模型组比较有统计学差异(P<0.01)，对于原代大鼠胰岛，模型组的磷酸化Akt减少，与正常组比较有差异(P<0.05)，保护组磷酸化Akt增强，与模型组比较有统计学差异(P<0.05)。见插页Ⅵ图2。
表3 SQ对氧化损伤RINm5F和原代大鼠胰岛
磷酸化Akt蛋白表达的影响(n=3，±s)
3 讨 论
中医糖尿病认为中焦脾胃受损，不能运化水谷为精气，脾胃升清受损，久之则气津两伤而为消渴。升清降糖合剂(SQ)在治疗上效法李东垣“健脾升阳”法，是根据中医升阳理论基础上发展的具有益气滋阴、升清降糖作用的临床经验方，治疗2型和1型糖尿病为主，可改善其临床证候，稳定血糖水平，降低糖化血红蛋白，调节血脂\[1\]。实验研究证明，H2O2干预24h可诱导体外胰岛细胞凋亡，升清降糖合剂明显提高氧化损伤胰岛细胞瘤株RINm5F细胞活性，其作用机制与提高SOD/MDA比例有关\[3\]。
, 百拇医药
氧化应激引起的功能损伤和细胞凋亡是1型糖尿病与2型糖尿病的发病和病程进展的共同机制，与线粒体及细胞凋亡途径密切相关。本实验中，流式细胞术检测保护组细胞凋亡率下降，可见一定浓度SQ具有抗氧化作用，减少胰岛细胞凋亡，保护其活性。
Bcl-2 蛋白家族成员在凋亡信号前期调节线粒体应答\[5\]，阻止线粒体蛋白如细胞色素C的释放，避免随之而来Caspase-9和Caspase-3的活化执行凋亡\[6\]。凋亡抑制蛋白Bcl-2的过表达可阻止细胞因子诱导的RINm5F细胞线粒体膜电位的破坏\[7\]。本实验通过免疫荧光激光共聚焦观察了RINm5F氧化损伤下Bcl-2和Bax蛋白表达，发现其表达在细胞浆中，模型组Bax较正常组明显增加，说明氧化损伤可增加凋亡诱导蛋白Bax的表达；而保护组Bcl-2较模型组明显增加，Bax减少，说明SQ可促进凋亡抑制蛋白Bcl-2，降低凋亡诱导蛋白Bax的表达，SQ的抗凋亡作用与调节凋亡相关蛋白有关。
Akt又称蛋白激酶B，在细胞存活和凋亡中起重要作用。胰岛素等生长和存活因子都可以激活Akt信号途径，Akt的Ser473可以被PDK1磷酸化，PI3 Kinase-Akt信号途径是一条经典的信号途径。Akt信号对糖尿病的胰岛素敏感性起关键作用。Akt还被证实在阻止迟发的细胞凋亡损伤和早期凋亡信号传导中作为一个关键调节者\[8，9\]。糖尿病造成包括神经和血管病变在内的的病理改变与氧化应激途径密切相关，胰岛素抵抗的氧化通路，包括活性氧族、线粒体通路、非耦联蛋白和内质网应激，这些通路最终连接到蛋白激酶B(Akt)，启动葡萄糖失耐受的内在因素——胰岛素通路，随后可致细胞凋亡损伤。本实验中，我们检测磷酸化Akt的表达，在RINm5F和原代大鼠胰岛中，模型组磷酸化Akt表达较正常组下降，可见H2O2可抑制Akt的磷酸化，引起细胞凋亡，而保护组磷酸化Akt较模型组上升，提示SQ可活化H2O2氧化损伤下PI3K通路中Akt使其磷酸化。值得注意的是，PI3K-Akt是糖代谢的主要通路之一，提示SQ有可能通过Akt通路参与调节糖代谢。
在本实验中，一定浓度H2O2可诱导胰岛细胞氧化损伤模型，流式细胞术提示细胞主要以凋亡改变，少数出现坏死，与糖尿病的病理改变基本相符。SQ通过促进凋亡相关蛋白Bcl-2的表达，抑制Bax蛋白表达，活化Akt途径达到抗氧化、抗凋亡的作用。
参考文献
[1] 倪小芬,胡臻,游欢庆,等.升清降糖合剂治疗糖尿病45例观察\[J\]. 新中医,2009,41(2):28-30.
\[2\] 霍丹群,刘佳,张伟,侯长军,谢果,张文.正交实验优选葛根复方的半仿生提取工艺\[J\].中成药,2004,(2):96-99., 百拇医药(倪小芬 胡臻 郑超 徐晓峰)