大孔树脂制备岩柏草总黄酮及其含量测定(1)
摘 要：目的：探索D-101大孔树脂分离纯化岩柏草总黄酮的最优工艺，并对有效成分穗花杉双黄酮进行含量测定。方法：紫外分光光度法测定总黄酮浓度，以黄酮收率、纯度等为指标，上样质量浓度、吸附流速和洗脱剂乙醇体积分数为影响因素，确定大孔树脂分离纯化岩柏草总黄酮工艺，并用高效液相色谱法测定总黄酮中穗花杉双黄酮。结果：大孔树脂对岩柏草总黄酮有较好的分离效果，其最优工艺条件为上样质量浓度8.5mg/mL，吸附流速为2mL/min，乙醇体积分数为70%，总黄酮得率为0.89%。流动相：乙腈-0.5%冰醋酸溶液，梯度洗脱；检测波长：338nm；流速：1mL/min，用HPLC法测得穗花杉双黄酮含量为56%。结论：用D-101大孔树脂分离纯化岩柏草总黄酮简单可行，精制效果好。用上述色谱条件可用于穗花杉双黄酮的质量控制。
关键词：岩柏草；穗花杉双黄酮；大孔树脂
中图分类号：R28文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2796-03
, 百拇医药
Separation and Purification of Total Flavonoids from Selaginella moellendorfii
Hieron by Macroporous Resin and Detected by HPLC
FANG Hongying，ZHUNG Rangxiao，WANG Fugen，XI Jianjun，ZHANG Yiqi，MIAO Liangbin
(The Sixth Hospital Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310014，Zhejiang，China)
Abstract:Objective：The study was to investigate the optimal technological parameters of the separation and purification process of Selaginella moellendorfii Hieron by D-101 macroporous resin.Method：UVspectrophotometry was used to determine the content of total flavonoids，and the effect of the work solution concentration，the absorption velocity，the concertration of ethanol on the absorption and desorption of macroporous resin by the losingrate，eluting rate，recovery，purity of total flavonoids were evaluated.Result：The D-101 macroporous resin had the best separating efficiency under the following technological conditions: the work solution concentration was 8.5 mg/mL;the absorption velocity was 2mL/min;the volume of the concertration of ethanol was 70%;mobile phase: ace-0.5% glacial acetic acid, gradientelution; detective wavelength: 338nm; flow rate: 1mL/min.Conclusion：This method is simple and feasible with good purification effect. The method is convenient and accurate for amentoflavone.
, 百拇医药
Key words:Selaginella moellendorfii Hieron; amentoflavone; macroporous resin
岩柏草为卷柏科卷柏属植物江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron的干燥全草，具有凉血止血，清热利湿的功效\[1\]，民间用来治疗肝炎、各种内外出血等疾病。文献报导其化学成分以双黄酮类为主，主要含穗花杉双黄酮\[2\]。穗花杉双黄酮具有抗肿瘤\[3\]、抗病毒\[4\]、血管舒张作用\[5\]。我院中药制剂复方茵柏合剂在临床治疗肝炎疗效确切，其中一味药是岩柏草，为了深入研究处方的物质基础，我们对岩柏草的总黄酮进行提取并进行含量测定。
大孔吸附树脂是近年来发展起来的新型分离技术，具有价廉、吸附容量大、可反复使用等优点，被广泛应用于中药有效成分分离纯化和天然药物化学成分提取和分离\[6\]。本实验拟通过大孔树脂纯化岩柏草提取物，以紫外-分光光度法进行总黄酮的含量测定。
, http://www.100md.com
1 仪器和试药
Agilent1200型高效液相色谱仪 (四元泵、自动进样器、柱温箱、ChemStations色谱工作站、DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司)，UV-2250型紫外-可见分光光度计(日本岛津)；BT25S型分析天平(德国sartorius)。
穗花杉双黄酮标准品(自制，HPLC含量测定>990%)、岩柏草产地浙江临安、D-101大孔树脂(天津市海光化工有限公司，批号091102)乙腈和甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 岩柏草总黄酮的提取
取岩柏草药材500g，用9倍量70%乙醇回流提取2次，每次lh，提取液过滤、合并、减压浓缩、真空干燥，得到固体22.5g，作为样品备用。取样品适量，加适量热水超声溶解，静置后抽滤，即得岩柏草样品液。
, 百拇医药
2.2 D-101大孔吸附树脂纯化和分离总黄酮
2.2.1 大孔吸附树脂的预处理 取适量D-101大孔吸附树脂用3BV无水乙醇浸泡24h，倾倒上层乙醇，然后装入玻璃层析柱，用无水乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，至流出液加去离子水不呈浑浊为止，并用去离子水以相同的流速冲洗树脂层至流出液没有醇味为止，然后进入酸碱处理阶段。
2.2.2 影响岩柏草总黄酮分离和纯化因素 (1)上样液质量浓度：用D-101大孔树脂饱和吸附质量浓度分别为4.5、6.5、8.5、10.5和12.5mg/mL的岩柏草提取液，以吸附量占总量的百分数作为吸附率，根据树脂对总黄酮的吸附率确定最佳上样液质量浓度。
(2)吸附流速：将提取液液分别以1、2、3、4 mL/min的流速通过D-101大孔树脂，收集每一树脂流出液体积，测定总黄酮质量浓度，根据泄露点及泄漏率的大小确定吸附流速。
(3)洗脱剂乙醇的体积分数：用D-101大孔树脂(树脂体积30 mL)饱和吸附总黄酮溶液，先用4倍树脂体积的蒸馏水洗脱，然后分别用体积分数30%、50% 、70 %、90%的乙醇洗脱，测定总黄酮质量浓度，根据洗脱率大小确定乙醇最佳体积分数。, 百拇医药(方红英 庄让笑 王福根 席建军 张袆奇 缪樑斌)
关键词：岩柏草；穗花杉双黄酮；大孔树脂
中图分类号：R28文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2796-03
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Separation and Purification of Total Flavonoids from Selaginella moellendorfii
Hieron by Macroporous Resin and Detected by HPLC
FANG Hongying，ZHUNG Rangxiao，WANG Fugen，XI Jianjun，ZHANG Yiqi，MIAO Liangbin
(The Sixth Hospital Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310014，Zhejiang，China)
Abstract:Objective：The study was to investigate the optimal technological parameters of the separation and purification process of Selaginella moellendorfii Hieron by D-101 macroporous resin.Method：UVspectrophotometry was used to determine the content of total flavonoids，and the effect of the work solution concentration，the absorption velocity，the concertration of ethanol on the absorption and desorption of macroporous resin by the losingrate，eluting rate，recovery，purity of total flavonoids were evaluated.Result：The D-101 macroporous resin had the best separating efficiency under the following technological conditions: the work solution concentration was 8.5 mg/mL;the absorption velocity was 2mL/min;the volume of the concertration of ethanol was 70%;mobile phase: ace-0.5% glacial acetic acid, gradientelution; detective wavelength: 338nm; flow rate: 1mL/min.Conclusion：This method is simple and feasible with good purification effect. The method is convenient and accurate for amentoflavone.
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Key words:Selaginella moellendorfii Hieron; amentoflavone; macroporous resin
岩柏草为卷柏科卷柏属植物江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron的干燥全草，具有凉血止血，清热利湿的功效\[1\]，民间用来治疗肝炎、各种内外出血等疾病。文献报导其化学成分以双黄酮类为主，主要含穗花杉双黄酮\[2\]。穗花杉双黄酮具有抗肿瘤\[3\]、抗病毒\[4\]、血管舒张作用\[5\]。我院中药制剂复方茵柏合剂在临床治疗肝炎疗效确切，其中一味药是岩柏草，为了深入研究处方的物质基础，我们对岩柏草的总黄酮进行提取并进行含量测定。
大孔吸附树脂是近年来发展起来的新型分离技术，具有价廉、吸附容量大、可反复使用等优点，被广泛应用于中药有效成分分离纯化和天然药物化学成分提取和分离\[6\]。本实验拟通过大孔树脂纯化岩柏草提取物，以紫外-分光光度法进行总黄酮的含量测定。
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1 仪器和试药
Agilent1200型高效液相色谱仪 (四元泵、自动进样器、柱温箱、ChemStations色谱工作站、DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司)，UV-2250型紫外-可见分光光度计(日本岛津)；BT25S型分析天平(德国sartorius)。
穗花杉双黄酮标准品(自制，HPLC含量测定>990%)、岩柏草产地浙江临安、D-101大孔树脂(天津市海光化工有限公司，批号091102)乙腈和甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 岩柏草总黄酮的提取
取岩柏草药材500g，用9倍量70%乙醇回流提取2次，每次lh，提取液过滤、合并、减压浓缩、真空干燥，得到固体22.5g，作为样品备用。取样品适量，加适量热水超声溶解，静置后抽滤，即得岩柏草样品液。
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2.2 D-101大孔吸附树脂纯化和分离总黄酮
2.2.1 大孔吸附树脂的预处理 取适量D-101大孔吸附树脂用3BV无水乙醇浸泡24h，倾倒上层乙醇，然后装入玻璃层析柱，用无水乙醇以2BV/h的流速通过树脂层，至流出液加去离子水不呈浑浊为止，并用去离子水以相同的流速冲洗树脂层至流出液没有醇味为止，然后进入酸碱处理阶段。
2.2.2 影响岩柏草总黄酮分离和纯化因素 (1)上样液质量浓度：用D-101大孔树脂饱和吸附质量浓度分别为4.5、6.5、8.5、10.5和12.5mg/mL的岩柏草提取液，以吸附量占总量的百分数作为吸附率，根据树脂对总黄酮的吸附率确定最佳上样液质量浓度。
(2)吸附流速：将提取液液分别以1、2、3、4 mL/min的流速通过D-101大孔树脂，收集每一树脂流出液体积，测定总黄酮质量浓度，根据泄露点及泄漏率的大小确定吸附流速。
(3)洗脱剂乙醇的体积分数：用D-101大孔树脂(树脂体积30 mL)饱和吸附总黄酮溶液，先用4倍树脂体积的蒸馏水洗脱，然后分别用体积分数30%、50% 、70 %、90%的乙醇洗脱，测定总黄酮质量浓度，根据洗脱率大小确定乙醇最佳体积分数。, 百拇医药(方红英 庄让笑 王福根 席建军 张袆奇 缪樑斌)