胆微透析技术及其在药学研究中的应用(2)
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参见附件。
计算体外回收率的公式：回收率=(Cdial/Cs)×100
4 胆微透析技术的应用
将胆微透析探针植入胆管中可用于监测正常无损伤动物胆汁中的药物浓度[7]。药物经过肝脏代谢后，会经胆汁排出体外，经胆汁排泄药物包括原型药与其代谢物。进行胆汁药物测定除可了解药物胆汁排泄的情况，还可研究药物的肠肝循环。微透析应用于胆汁中药物动力学的研究，是将一个胆分流探针置入大白鼠的胆管，胆汁进入探针后会被分流回肠道中，不会造成胆汁的流失，亦不会影响胆汁正常排泌，可用于长时、持续的收集检测排泄于胆汁中的未结合型的原型药物与其代谢物[15，20]。
4.1 经胆囊排泄药物药物动力学研究
4.1.1 通过联用液相色谱法与在线微透析技术 测定大鼠胆汁中非结合型的头孢吡肟药代动力学 将一个微透析探针插入位于肝脏和十二指肠之间的总胆管中，接着静脉注射头孢吡肟，按50 mg/kg给药，将头孢吡肟从透析液中分离并进行定量测定。通过使用一个全多孔型硅胶硅烷化键合固定的反相碳18柱(250m×4.6mm，5mm)，维持室温不变[16]。样品用流动相进行洗脱，流动相是浓度为100 mM、pH 为3.0的磷酸二氢钠与甲醇的混合液，比例是87∶13，紫外分光光度检测器的波长选择270 nm，结果表明头孢吡肟在胆汁中的消除半衰期是64.01+/-9.32 min[17-19]。该研究也是药物在胆汁排泄中微透析技术应用的一个典型例子。
4.1.2 氯霉素与其葡糖苷酸衍生物经胆汁排泄的微透析研究通过使用微透析探针结合自动的在线微孔高效液相色谱法，评估氯霉素及其葡糖苷酸衍生物的胆汁排泄。将微透析探针插入位于肝脏和十二指肠之间的胆管中，静脉注射琥珀酸钠氯霉素，按100mg/kg给药后，收集并测定胆汁透析液中非结合型的氯霉素及其葡糖苷酸衍生物的量。药物动力学研究结果显示氯霉素的在胆汁中的处置过程符合二室模型，然而氯霉素葡糖苷酸衍生物的处置过程符合单室模型。测得胆管中氯霉素葡糖苷酸衍生物的浓度-时间曲线下面积是氯霉素的两倍，氯霉素葡糖苷酸衍生物胆汁排泄的清除率明显高于氯霉素，表明氯霉素葡糖苷酸衍生物被更多排泄进入胆汁中[21]。
4.1.3 小檗碱经肝胆管排泄的药动学研究小檗碱是从具有芒刺的小檗属或黄连的根及树皮分离出来的具有生物活性的成分。联用了体内微透析技术和高效液相色谱法对小檗碱药代动力学和肝胆管排泄的机制进行了研究。对照组大鼠仅仅给药小檗碱，而药物治疗组在给予小檗碱10 min前，先注入P-糖蛋白抑制剂黄孢霉素A，有机阳离子的传送器和P-糖蛋白抑制剂奎尼丁，细胞色素P450抑制剂SKF-525A(普罗地芬)以及葡萄苷酸化抑制剂丙磺舒。结果表明在剂量范围10~20 mg/kg时，小檗碱呈现出线性药代动力学现象，浓度-时间曲线下面积也随着剂量的增大成比例的增加[22]。此外，小檗碱经肝胆管排泄所需的浓度梯度，是以小檗碱在胆汁和血液中的分配比为根据；由于同剂量给予小檗碱和黄孢霉素A或者奎尼丁10 mg/kg，小檗碱的活性成分可能会受P-糖蛋白和有机阳离子的传送器的影响，胆汁中小檗碱的含量明显下降了。此外，通过液相色谱法和光谱测定法鉴定，小檗碱是在肝脏中进行代谢的，分别是I相的脱甲基作用和II相的葡萄苷酸化作用。当给予治疗组SKF-525A时，小檗碱部分的第I相代谢反应下降了，但是小檗碱的第II相反应-葡萄苷酸化作用不受丙磺舒的明显影响[23]。
4.1.4 通过在线微透析技术联用微内径液相层析的荧光检测，测定大鼠胆汁中的非结合型20(S)-喜树碱将线性胆汁探针埋植于肝脏和十二指肠之间的胆管处，透析液则连接至带有荧光检测功能的高性能微孔液相层析柱上。样品用流动相洗脱，流动相是甲醇与浓度为100 mM的磷酸二氢钠的混合液，比例是35∶65，用磷酸调溶液的pH至2.5[24]。喜树碱的定量限是1 ng/mL，接着静脉注射5 mg/kg喜树碱。
4.2 肠肝循环药物药动学研究
4.2.1 通过使用肝十二指肠微透析探针，研究氯霉素及其葡糖苷酸衍生物的肠肝循环该实验以肝十二指肠探针，将药物治疗组供体大鼠的胆汁通过胆插管与非治疗组受体大鼠的十二指肠相连接，用以评价氯霉素在药代动力学中的应用-肝代谢作用和肠肝循环。非结合型的氯霉素及其葡糖苷酸衍生物的血药浓度是通过联用在线微透析技术和微孔液相色谱法测定的。结果表明在供体大鼠和受体大鼠的血液中，均能检测到氯霉素及其葡糖苷酸衍生物，接着对供体大鼠静脉注射琥珀酸钠氯霉素，按100 mg/kg剂量给药。研究发现，虽然肠肝循环仅为一个小范围(约1.8%)[25]，但也参与了非结合型氯霉素的处置过程，在线微透析技术对于该研究是适用的。
4.2.2 通过使用胆微透析探针，研究胆汁盐对咖啡因与酚酞葡糖苷酸重吸收的影响 通过咖啡因与酚酞葡糖苷酸两种分析物进行对比，表明胆盐可通过微透析探针影响分析物的重吸收，胆盐可与酚酞葡糖苷酸相互作用，但不能与咖啡因相互作用。结果还表明当把胆盐考虑在内时，体外探针的校准可以用来计算体内分析物在胆汁中的浓度，通过体外回收萃取效率校正的体内酚酞葡糖苷酸透析液浓度与体内胆汁中测得的浓度一致。
酚酞葡糖苷酸是一个典型的已知经肠肝循环的葡糖苷酸缩合物，当给与酚酞时，可被快速、广泛的代谢为酚酞葡糖苷酸并经胆汁分泌。一旦到达肠腔，酚酞葡糖苷酸被水解，酚酞可重吸收进入门脉循环。酚酞是在肝脏中生物转化为高分子量的典型化合物，然后再经历肠肝循环。酚酞-酚酞葡糖苷酸已作为肝功能和肠肝循环研究的模型化合物，具有转移和完整胆汁流量的麻醉大鼠的体内酚酞葡糖苷酸以用于微透析取样。
结果表明用胆微透析探针，咖啡因的提取效率比酚酞葡糖苷酸高，与浓度无关，也不受胆盐的影响。而酚酞葡糖苷酸可与胆盐相互作用，在胆盐中的提取效率比在林格氏液中更低。当灌注液中胆盐成分与探针所在基质的成分相近时，萃取效率与回收率相等。体外回收实验表明，酚酞葡糖苷酸在BSR中的浓度范围0.1～10 mM时，体外提取效率与浓度无关，重现性好，因此适用于分析体内试验数据。另外，用体外萃取效率校正的透析液酚酞葡糖苷酸的浓度与直接测得的胆汁样品浓度吻合。
5 结 语
胆微透析技术是微透析技术的一种，是一门新兴的、用途广泛的技术，是将一种具有透析作用且充满液体的微细探针置于胆管内, 与探针周围组织进行物质交换后测定其内的化学物质含量的技术。胆微透析具有定量、定位、微分析、连续取样、动态分析的特点，为胆管给药的药效和药代动力学研究提供可靠和全新的手段，这无疑是方法学上质的突破。胆微透析技术有很多优点，同时也有不足之处，对胆微透析探针的校正和对微量样品分析方法的要求是仍需要继续研究的问题。
参考文献
[1] BERTERA F M, MAYER M A, OPEZZO J A, et al ......
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