基于衍生化反应和GC-MS技术测定大鼠血液和尿液中内源性代谢物轮廓谱(2)
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参见附件。
1.3生物样品制备
取200μL冻后样本加入200μL乙睛沉淀蛋白，冰浴超声10min后，离心分离10min(10000r•min-1)。取一定体积上清液置GC进样瓶，N2气吹干。加15mg/mL甲氧胺吡啶溶液50μL，旋涡混匀30s，70℃下肟化1h后加衍生化试剂(MSTFA∶TMCS=100∶1，V/V)50μL，混匀，静置1h。移取上清液到微量进样管，供GC-MS分析。
1.4 GC-MS条件
进样量，1μL；进样口温度，270℃；载气，超纯氦(99.9996%)；流量，1mL/min；接口温度：260℃；色谱柱DB-5MS毛细管柱；不分流进样。升温程序见表1。质谱条件，离子源温度，200℃；检测质荷比范围30～600；溶剂延时，5min；扫描速度：20张图谱/s。
2结果和讨论
2.1代谢物鉴定
使用NIST质谱数据库2002版对GC-MS分析的色谱峰所代表的代谢物进行鉴定。并结合标准对照，根据检测到的代谢物EI质谱碎片和数据库中的标准物质的质谱信息以及标准品的EI碎片信息进行比对。共鉴定了氨基酸、有机酸、糖类和胆固醇等23个化合物。标准品的GC-MS总离子流图及质谱峰化合物归属分别见图1和表2。
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度和重复性 分别对同一制备好的尿液和血液样品连续进样6次，计算主要共有峰的峰面积相对标准偏差。尿液样品中23个主要共有峰的峰面积相对标准偏差范围在2.47%～8.96%之间，全部共有峰的峰面积相对标准偏差小于10%。血液样品中29个主要共有峰的峰面积相对标准偏差范围在1.38%～6.78%之间，全部共有峰的峰面积相对标准偏差小于10%。说明仪器精密度良好。
平行制备尿液样品和血液样品各6份，分别测定，计算主要共有峰的相对标准偏差，尿液样品的主要共有峰相对偏差在3.11%～15.32%之间，血液样品的主要共有峰相对偏差在2.14%～13.36%之间。说明该样品制备方法重复性良好。
2.2.2 样品稳定性 主要考察样品在冻融过程中的稳定性。取尿液和血液样品按照1.3项下制备供试品各3份，经过一个冻融循环后，再取同样样品采用相同方法制备供试品各3份。尿液和血液供试品各6份，GC-MS测定，并计算主要共有峰的峰面积相对标准偏差。结果显示，主要共有峰的峰面积相对标准偏差均小于15%，说明样品在一个冻融循环周期能保持稳定。
2.3 衍生化条件的选择
生物体内的代谢物，如血液和尿液中的氨基酸、脂肪酸、胺类、糖类和甾体类物质，这些物质具有极性强、挥发性低的共同特征，往往不适合进行GC-MS分析。如果将这些物质进行适当的化学处理转化成相应的挥发性衍生物，不仅可以用GC-MS进行测定，而且生物样品中结构近似的化合物在质谱中更容易被区分。因此，建立一种简单有效的生物样品中代谢物的衍生化方法可以使GC-MS技术更好得到应用。在气相色谱中，常用的衍生化反应有硅烷化反应、烷基化反应、酰基化反应、缩合反应等等。综合考虑到反应试剂的毒性、操作过程的难易和重复性等等因素，本文采用硅烷化试剂对生物样品进行衍生化反应，其原理主要是通过硅烷基取代羟基、羧基、巯基、氨基及亚氨基等集团上的活泼氢，而产生热稳定性好、挥发性强的硅醚或硅酯，可直接进行GC-MS分析。经过参考文献与反复实验[3]，确定了本文中生物样品制备的衍生化条件。
2.4 GC-MS代谢物谱分析
血浆和尿液GC-MS总离子流(TIC)图如图2和3所示。通过将半挥发或不挥发的代谢物衍生化的方法，GC-MS可以分析生物体液中各种性质的代谢物。本实验检测到尿液中93种代谢物和血浆中的86种共有代谢物(部分已鉴定代谢物见表2)，它们分别构成了大鼠尿液和血浆的生物代谢物谱。方法学实验表明，所选GC-MS分析方法具有较好稳定性和重现性(各共有峰RSD均小于15%，n=6)。对已有的生物对照品进行线性考察，结果表明尿液和血浆中的绝大多数代谢物在其所在的浓度范围内线性良好(R2>0.99)，但血浆中的乳酸、磷酸和葡萄糖，以及血浆中的尿素由于本身在体内含量丰富，出现过载现象。GC-MS分析生物体液的代谢物谱主要含有氨基酸类、有机酸类、糖类和脂类等物质，这些物质在生物体内的含量与机体内氨基酸代谢、能量代谢和脂类代谢等代谢状况密切相关。疾病的发生会使体内的代谢体系发生异常，代谢物被扰动后，能在代谢物轮廓谱中以色谱峰的个数的改变或峰面积的增加或减少而体现出来。因此，对于生物体内代谢物网络的轮廓进行分析，对疾病的诊断、临床干预治疗和药物作用机制的研究具有积极的意义。
3 结 论
本实验将衍生化技术与气相色谱-质谱联用技术结合，建立了测定大鼠血液和尿液中内源性代谢物指纹谱的方法，并采用NIST数据库与标准品比对的方法鉴定了指纹图谱中主要的23个共有色谱峰。在血液和尿液中的主要代谢产物为氨基酸类、脂肪酸类、有机酸类、胺类、糖类和固醇类物质，其与机体内氨基酸代谢、能量代谢和脂类代谢等代谢状况密切相关。因此，优化的衍生化方法结合GC-MS技术可以从代谢水平对内源性代谢物进行分析，为后期的病理模型中内源性生物标志物的发现提供最佳的测定技术和方法 ......
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