扶正化瘀方抗肝癌前病变的分子机理研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
中医认为肝癌多属“癥瘕积聚”的范畴，其乃是由于正虚邪恋致瘀而成。前期研究[2]表明,扶正化瘀方治疗肝癌可抑制肿瘤生长，提高生活质量,延长生存期。中医药的治疗机制被公认为是整体调节，本实验针对肝癌形成病机，确立以扶正化瘀法为治疗大法，选取c-myc、CyclinD1、CDK4为中医药作用的微观靶点，通过与中药单药有效提取成分苦参素比较，系统研究扶正化瘀方对大鼠肝癌前病变细胞周期调控以及癌基因表达的影响，从分子生物学水平探讨肝细胞癌变的分子机制以及扶正化瘀方预防肝癌的作用机理。
1材料与方法
1.1 实验材料
清洁级SD雄性大鼠80只，体重(150±10)g，饲料由牡丹江医学院实验动物中心提供。DEN，Sigma公司；CDK4羊多抗、cyclinD1单抗购自Santa Cruz公司； RT-PCR试剂盒、PCR Marker购自Promega公司；Trizol RNA，Invitrogen公司；上、下游引物设计使用Primer5.0软件，由上海捷倍思基因技术公司合成。梯度PCR仪、DNA热循环仪Eppendof 100型德国；DU640核酸分析仪美国；电泳凝胶图象分析系统 Backman公司；低温高速离心机CR21 日本日立。扶正化瘀方组成：黄芪、焦术、黄精、红参、三棱、莪术、丹参、石见穿等。按正交试验法筛选工艺，以最佳流程制备，制成含生药1.0g/mL的中药制剂。
1.2 动物分组与处理
清洁级SD大鼠80只，按照随机化分组原则分为：空白组、单纯致癌组、扶正化瘀方组、苦参素组，每组各20只，相同条件下分笼饲养。按改良的Solt Farber氏方法制作大鼠肝癌前病变模型。第1周，空白组以外各组腹腔注射DEN水溶液，剂量为100mg/kg，空白组同步腹腔注射同体积生理盐水。从第2周起，各造模组每周按70mg/kg的DEN水溶液剂量，连续灌胃16周，同时，空白组灌胃同体积生理盐水；实验第1天开始扶正化瘀方组、苦参素组即每天分别灌胃中药制剂和苦参素注射液，药物剂量均按成人每日每公斤体重用量换算为大鼠用量，直至实验结束。各组大鼠在饲养l8周后全部处死。
1.3 取材及检测
RT-PCR技术进行c-myc mRNA转录分析；免疫组织化学法检测Cyclin D1、CDK4蛋白表达；显微镜下观察病理组织学变化。
1.3.1 肝组织病理形态学观察分别取各组大鼠同一叶相同部位肝脏组织作石蜡包埋切片，HE染色后于光镜下行病理形态学观察。
1.3.2 RT-PCR法检测肝细胞c-myc mRNA的表达
肝组织细胞总RNA提取按照Trizol RNA试剂说明书进行,PCR扩增反应总体积为25μL。扩增程序为:(变性:94℃30s→退火:55℃60s→延伸:68℃60s)×30个循环后→72℃延伸5min。采用Kodak2.0软件对PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行扫描分析及数据处理。
1.3.3免疫组化检测肝细胞Cyclin D1、CDK4蛋白表达
取材肝组织固定于100mL/L缓冲福尔马林24h，常规石蜡包埋，切4μm厚切片，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，染色方法为免疫组化ABC法。以0.1mol/LPBS取代一抗作阴性对照，以正常大鼠肝组织作正常对照。利用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统对大鼠肝组织染色切片平均灰度值进行定量检测。
1.4统计学处理
数值以均数±标准差表示(±s)，用SPSS 13.0软件进行分析。多组间比较用F检验进行方差分析，两两比较用LSD-t检验，ɑ=0.05作为差异具有统计学意义的标准。
2 结 果
2.1 肝组织病理形态学改变
空白组：肝细胞形态正常，排列完整，肝小梁、肝血窦排列正常。单纯致癌组：增生结节形成明显，肝细胞异型性增生，大部分细胞出现核异质变，细胞核仁普遍增大，某些增生灶中出现癌变细胞。扶正化瘀方组、苦参素组大鼠肝脏病变均较单纯致癌组轻。扶正化瘀方组肝组织纤维化，(1/3)标本中几乎1/3都是纤维结缔组织，增生结节形成不明显，未见肝细胞核异质变；苦参素组肝组织纤维化明显，(2/3)标本中几乎2/3都是纤维结缔组织。增生结节形成明显，数量增多，有部分细胞出现核异质变。
2.2肝组织癌基因c-myc mRNA表达变化
RT-PCR产物在琼脂糖电泳凝胶紫外灯下均可见：各组β-actin电泳条带亮度一致，扩增片段均为661bp；c-myc扩增片段均为398bp，但各组电泳条带亮度有明显差异(见图1～2)。
空白组大鼠肝组织癌基因c-myc mRNA均为低表达或几乎不表达，单纯致癌组和扶正化瘀方组、苦参素组均表现为c-myc的高表达，与空白组相比，单纯致癌组肝组织c-myc mRNA相对表达量明显增高(P<0.05)。扶正化瘀方组、苦参素组c-myc mRNA相对表达量均明显少于单纯致癌组，有显著统计学差异(P<0.05)；扶正化瘀方组与苦参素组比较有统计学意义(P<0.05)(见表1)。
2.3 肝组织CyclinD1、CDK4蛋白表达
单纯致癌组和扶正化瘀方组、苦参素组中cyclinD1 、CDk4的平均积分光密度均非常显著的高于空白组，单纯致癌组与空白组比较，有显著差异(P<0.05)。扶正化瘀方组、苦参素组cyclinD1 、CDk4的平均积分光密度均明显少于单纯致癌组，有显著统计学差异(P<0.05)；扶正化瘀方组与苦参素组比较有统计学意义(P<0.05)(见表2～3)。
3 讨 论
目前，我国对肝癌预防的研究具有重要性和迫切性。深入研究肝癌前病变机制，并针对高频出现于肝硬化组织、异型增生结节及微小肝细胞癌结节中的早期分子变异进行早期诊断及治疗，将会对减缓甚至阻断癌前病变进程具有重大意义。近年来，随着综合治疗概念的确立，中医药积极参与了肝癌的防治。本实验以肝癌前病变为切入点，观察了此阶段的病理特点，基因水平变化以及扶正化瘀方的干预作用，初步阐明扶正化瘀方抑制大鼠肝癌前病变的作用机制。研究表明，正常细胞通过细胞周期检查点(check point)来控制细胞周期进程，而细胞周期控制的紊乱是肿瘤发生的前提[3]。参与控制细胞周期的因子有多种，其中最重要的是细胞周期素依赖激酶(CDKs)和细胞周期素(cyclin)。D型细胞周期素(D1、D2和D3)与CDk4和CDk6结合，调节G1期到S期的发展过程[4]。c-myc被证明为细胞增殖必不可少的早期基因，其表达产物在细胞增殖过程中是调控转录的反式作用因子，是细胞增殖信号转导的必需因子[5]。c-myc亦是控制G0～S期转换的关键性蛋白因子，促进细胞内DNA合成，在细胞增殖、分化和细胞周期中起重要作用[6]。
本研究显示，扶正化瘀方组、苦参素组大鼠肝脏病变均明显轻于单纯致癌组，两治疗组c-myc mRNA水平、CyclinD1、CDK4蛋白表达均明显少于单纯致癌组，具有显著统计学差异(P<0.05)，扶正化瘀方组与苦参素组比较有统计学意义(P<0.05)，表明扶正化瘀方对肝癌前病变有一定的抑制作用 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(1888kb)。