软脉煎对实验性晚期动脉粥样硬化家兔平滑肌细胞凋亡的调控作用(2)
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参见附件。
1.2.3 免疫组织化学检测右颈总动脉Bcl-2、Bax、Caspase-8的表达石蜡包埋，伊红染液。滴加适当稀释一抗，4℃下18h； 0.04%DAB+0.03% H2O2显色8min；水洗，苏木素衬染30s，水洗，盐酸乙醇蓝化2s，水洗，微波蓝化，常规树脂封片；显微镜下观察，阳性为棕黄色或棕褐色，并呈颗粒状，背景呈紫蓝色。图象扫描分析免疫组化染色阳性面积。
1.3统计学处理
实验数据采用SPSS 15.0 for Windows 统计软件包进行数据统计，其中各组均采用(±s)表示，统计显著性水平为P<0.05。
2结 果
2.1软脉煎对右颈动脉平滑肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响
见表1。模型组Bax蛋白表达、Bcl-2/Bax值均较正常对照组显著升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达量较正常对照组显著降低(P<0.05)；两治疗组Bax蛋白表达、Bcl-2/Bax值较模型组显著降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达量较模型组显著升高(P<0.05)。两治疗组见平滑肌细胞Bax蛋白表达有显著性差异(P<0.05)，Bcl-蛋白表达、Bcl-2/Bax值均无统计学意义(P>0.05)。
2.2软脉煎对右颈动脉平滑肌细胞Caspase-8蛋白表达的影响
见表2。模型组、软脉煎组Caspase-8蛋白表达都有不同程度升高，仅模型组与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05)，两治疗组Caspase-8蛋白表达与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05)。两治疗组Caspase-8阳性面积较模型组相比，均有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)。两治疗组间Caspase-8蛋白表达量无统计学意义(P>0.05)。
3讨 论
近年研究认为，细胞凋亡可能是动脉粥样硬化病变中细胞死亡的主要方式，平滑肌细胞凋亡失调和凋亡小体清除不足可能是加剧As发展的重要因素。纤维帽中细胞凋亡增加可降低斑块稳定性而致急性临床事件发生[3]。细胞凋亡是一系列基因活动引起的级联反应的结果。由诱导基因和抑制基因共同调控。Bcl-2具有抗细胞凋亡功能，能通过抵抗多种形式的细胞凋亡延长细胞寿命。Bax是Bcl-2的同源基因，其过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应使细胞趋于凋亡[4]。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能[5]。Bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体(Bcl2/Bax)与同二聚体(Bax/Bax)的比值，这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用。当一细胞系的所有细胞内异二聚(Bcl-2/Bax)的含量≥50% 时，则细胞耐受凋亡。而当细胞内Bax同二聚体>80% 时且在适当信号诱导下则细胞出现凋亡。
本实验发现软脉煎组Bax蛋白表达、Bcl-2/Bax值均显著低于模型组，Bcl-2表达量显著高于模型组。故推测软脉煎的作用机制可能是通过Bax/Bcl-2异源二聚体与Bax-Bax同源二聚体竞争Bax，减少诱导凋亡的同源二聚体的形成，表明软脉煎可以从蛋白水平调节血管平滑肌细胞凋亡，在动脉粥样硬化的形成晚期，通过降低斑块肩部及纤维帽处的凋亡率，以提高斑块的稳定性，减少心脑血管事件的发生。
凋亡能在信号途径的许多点被打断，可从抑制或防止刺激因素以及抑制凋亡途径防止细胞凋亡。抑制凋亡的方法决定于阻断细胞凋亡级联环节中的关键步骤，如果凋亡是多途径的，阻断某一途径并不一定能抑制凋亡，因为还可经其他途径引起凋亡。针对多信号途径的介质可能是抑制凋亡的较好的靶标。从细胞凋亡的内外两条信号途径我们可以看出Caspase-8是细胞凋亡信号途径中的关键步骤，同时涉及两条信号通路，并且是针对多信号途径的上游介质[6-7]，因此我们将Caspase-8作为我们本项研究的靶标。
本实验观察到软脉煎组Caspase-8蛋白表达显著低于模型组，提示软脉煎能通过干预细胞凋亡信号途径中的多信号途径介质Caspase-8来抑制凋亡，从而降低动脉粥样硬化晚期粥样斑块的凋亡，以增强粥样斑块的稳定性，防止心脑血管意外的发生。
以往动脉粥样硬化的中医研究，基本上把AS归属于“血瘀”、“痰浊”范畴，在治疗上多集中于消除“痰”、“瘀”，而笔者认为AS与肾气亏虚有关，肾虚与痰瘀有着因果的联系。动脉粥样硬化病位在血脉，为心所主，其本在肾。心主血脉，肾主藏精，心肾之间不仅精血同源互补，而且有着经脉、水火的联系，两脏上下协调，功能相助。心主血脉的功能正常发挥需要肾气的推动，肾精化血充脉等，正如《内经》所云“心之合脉也，其茶色也，其主肾也。” 动脉粥样硬化的病理基础是痰和瘀。痰、瘀为病之标，其本在脏腑的功能失调，气血津液运行、代谢发生障碍，与肾有密切的关系。肾阴不足，虚火内生，灼津炼液，而成痰浊。正如《医林改错》所谓：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。”痰浊壅阻脉道，痰借血体，血借痰凝，滞而为瘀，胶结血脉，心气营运不畅，遂成粥样斑块。且AS多见于40岁以后，中年向老，肾元亏虚，精气渐衰，髓海渐空，脏腑功能也随之衰弱，可见AS多发生于人体肾气开始亏虚的时候。故补气须补元气，主要是肾中精气。软脉煎全方配伍，补肾益气，阴阳共济，共奏精气同补之功。我们的研究表明，具有补肾益气作用的软脉煎在AS形成的晚期能减少血管平滑肌细胞的凋亡，维持斑块的稳定性。进一步证实AS的病因病机为痰瘀是标，肾虚精血不足是本。提示我们从中医“治病必求于本”的理论出发，以补虚为主进行治疗这一方法，具有一定的科学性。
参考文献
[1] 赵明中.全球性动脉粥样硬化血栓病人健康调查启动——REACH调查研究以及提高居全球致死率榜首的动脉粥样硬化血栓疾病的认识[J].中国医药导刊，2004，6(3):234.
[2]周杰，钱振准. 中医药防治动脉粥样硬化研究进展[J]. 安徽中医学院学报，1998，17(3)：60.
[3]覃军，何作云. 管状动脉粥样硬化斑块破裂的细胞与分子生物学研究进展[J] ......
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