益气补肾法对自然流产模型小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响(2)
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参见附件。
⑥其它：实验前，不加任何干预，将小鼠饲养1周，使其很好地适应环境。
1.1.2 实验药品
①生理盐水(0.9%NS):购于浙江省中医院西药房，中国广州百特医疗用品有限公司生产。批号:GS0808014。
②CSA溶液:商品名为：新山地明，25mg×50粒，瑞士诺华制药生产，批号为：S0072。原品为软胶囊，内容物为淡黄色油状液体。溶液制备方法为：先制备0.1%的甲醇溶液(0.1mL的无水甲醇加入99.9mL的蒸馏水中)，避光保存，灌胃前1～2h将CSA胶囊放入装有25mL甲醇溶液的小烧杯中，待胶囊软化后，用1mL针筒的针头将其刺破，使内容物充分溶于甲醇溶液，待用。
③实验方：实验方药及剂量：黄芪36g，党参12g，当归6g，陈皮12g，升麻12g，柴胡12g，白术18g，菟丝子30g(补中益气汤为主加菟丝子)。上述生药均购于浙江省中医院中药房。制备方法如下:各药按比例称取，置于瓦罐中，加水适量，浸泡30min。先用武火加热煮沸，再改用文火煎30min，滤出药液。再向药渣中加入适量清水煎煮1次，滤出药液。将两次药液混合，放入烧杯中加热，精确浓缩至每毫升药液含生药2g。然后贮于消毒容器中，密封，放置于4℃冰箱中备用(浙江中医药大学实验室提供)。每次给药前，取出适量药液，加热至室温，其余仍保持于冷藏状态。
1.1.3 实验试剂
①PE Conjugated anti-mouse CD3e：美国eBioscience公司生产。产品编号：12-0031-81。产品批号：E030114。
②FITC Conjugated anti-mouse CD4：美国eBioscience公司生产。产品编号：11-0041-81。产品批号：E030114。
③Phycoerythrin-Cy5(PE-Cy5) anti-mouse CD8a(Ly-2)：美国eBioscience公司生产。产品编号：15-0081-81。产品批号：E026284。
④小鼠淋巴细胞分离液LTS1092：天津TBD灏洋生物制品科技有限责任公司生产。产品批号：20090515。⑤RPMI-1640培养液:内含300mg/L谷氨酰胺，2g/L碳酸氢钠，Millipore 0.22μL滤膜过滤除菌，pH值：7.2±0.2，内毒素≤0.1ng/mL，吉诺生物医药技术有限公司生产，产品批号：09032705。⑥
磷酸盐缓冲液(PBS溶液)：Millipore 0.22μL滤膜过滤除菌，pH值：7.2±0.1，吉诺生物医药技术有限公司生产，产品批号：09101902。
⑦D-Hank’s液：吉诺生物医药技术有限公司生产，批号：08102905。
1.1.4 主要实验设备和仪器
①漩涡混合器：XW-80A型，上海医科大学仪器厂。
②低速自动平衡离心机：LDZ5-2型，北京京立离心机有限公司。
③冷藏冷冻箱：BCD-208A/D型，中国海尔集团。
④光学显微镜：CX31RTSF型，日本OLYMPUS公司。
⑤微量移液枪：0.1-5000μL，德国Eppendorf公司。
⑥流式细胞仪：Facs Calibur基本型，美国BD公司(Becton， Dickinson and Company)。
⑦血球计数板：XB-K-25型，上海求精生化试剂仪器有限公司。
1.2 实验方法与步骤
1.2.1 建立自然流产小鼠模型
将雌性CBA/J与雄性DBA/2小鼠以2∶1比例合笼交配，每日晨8∶00-9∶00检查雌鼠阴道。若见到阴栓，则造模成功，视为孕0天；未见到阴栓，则继续合笼。
1.2.2 实验分组
①阴性对照组(生理盐水)：于妊娠第0天开始，以10mL/kg的剂量灌服NS。
②中药组(益气补肾中药)：于妊娠第0天开始，以27g/kg(临床用量的10倍)的剂量灌服实验方。
③环孢素(CSA)组：于妊娠第4天，以10mg/kg的剂量灌服CSA溶液。
④中西医结合组(中药+CSA)：于妊娠第0天开始，以27g/kg的剂量灌服实验方；于妊娠第4天，以10mg/kg的剂量灌服CSA溶液。
1.2.3 实验步骤
动物实验在浙江中医药大学动物实验中心进行，设施条件合格证号：SYXK(浙)2008-0115。于孕第9天、14天，用颈椎脱臼法分批处死小鼠(先以摘眼球法取血，供实验二用)，用75%的乙醇消毒后，钝性分离皮肤及腹膜，取脾脏，制成单细胞悬液，采用流式细胞术分析T淋巴细胞亚群的表达情况。
①制备脾脏单个淋巴细胞悬液:
取出小鼠脾脏后，将其用PBS液冲洗1遍,置于加有2mL RPMI-1640培养液的培养皿中，左手持一把小镊子夹住脾脏，右手用1mL的注射器抽取平皿内液体缓缓注入脾脏内，将脾细胞冲洗出来，如此反复冲洗，直到脾脏变白为止。用微量移液枪转移细胞悬液至事先加入等体积小鼠淋巴细胞分离液的试管中，以2000r/min的速度离心15min后，用移液枪吸取云絮层溶液(即淋巴细胞层)至加有4mL D-Hank’s缓冲液的试管内，1500r/min离心10min，弃上清液，加入1mLPBS缓冲液反复冲打，离心洗涤2次。用血球计数板计数细胞，并调节细胞浓度至1×107/mL，制成脾脏单个淋巴细胞悬液，待检。
②细胞染色和流式细胞分析术(FCM)分析：
每次取100μL上述悬液，标准化法标记细胞，具体单抗添加方法见表1。
加抗后，用漩涡混合器振荡，促进细胞和单抗充分反应，避光孵育30min，再以PBS缓冲液洗涤1次，然后将细胞重悬于500μL PBS液中，即刻上机，用Cell Quest软件获取细胞,每份样本检测1×105个细胞, 结果以CD4+T细胞占CD3+T细胞的百分比、CD8+T细胞占CD3+T细胞的百分比、CD4+T细胞/CD8+T细胞的百分比来计算。测试完毕后用Cell Quest Pro软件分析数据。
1.3 统计学方法
所有资料用均数()±标准差(S)表示，组间比较应用单因素方差分析，进一步两两比较应用LSD-t检验，SPSS 13.0统计分析软件处理数据，P<0.05表示有显著性差异,P<0.01表示有极显著差异。
2 实验结果
2.1 一般情况
观察小鼠精神状态、活动情况、饮食、二便、毛发光泽度等情况正常。
2.2 各组脾脏T细胞组成的差别 ......
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