自然铜和鹿衔草对裸鼠肺癌骨转移的抑制作用(2)
 |
| 第1页 |
参见附件。
1.1.4 仪器JW2502 电子分析天平:上海天平仪器厂产品。Olympus CKX41 - 32倒置显微镜:日本olympus 光学公司产品。MCO-175 CO2培养箱:日本三洋公司产品。流式细胞仪美国Beckman公司产品，型号：FACScalibur。
1.2 肺癌骨转移动物模型建立[5]
A549单细胞悬液用1640培养基(pH 7.0)加15%小牛血清于37℃5%二氧化碳培养箱中培养，注射前PBS洗净，并调节细胞浓度到1×107个•mL-1。裸鼠戊巴比妥腹腔注射麻醉后用75%酒精消毒股骨及胫骨处皮肤，取19G针头直接于骨性粗隆上刺透骨皮质，然后将针尖插入骨干内注入0.1mL的单细胞悬液。注射完后饲养于动物实验中心SPF环境中，14天后用于实验。
1.3 分组
随机分为3组，每组10只。模型对照组：隔日灌胃生理盐水0.5mL，隔7天腹腔注射生理盐水0.16mL;阳性对照组：隔日灌胃生理盐水0.5mL，隔7天腹腔注射帕米磷酸二钠0.16mL;中药组：隔日灌胃自然铜和鹿衔草0.5mL，隔7天腹腔注射生理盐水0.16mL。
1.4 观察内容
各组裸鼠给药3周后，用摘眼球法采取血液样本，此后断颈处死，剥离肿瘤组织。
1.4.1 肿瘤组织病理特点
肿瘤组织置于脱钙液中3天后，于4%多聚甲醛中固定24h，石蜡包埋，组织切片。HE染色后，观察肿瘤组织镜下特点，并以免疫组化确诊。
1.4.2 体重
实验前测量各组的体重，处死前再次测量体重。
1.4.3 测量肿瘤的长短径 按以下公式计算出抑瘤率[1]：
肿瘤体积(mm3)=π/6×a×b2(a为长径,b为短径)；抑瘤率=(V1-V2)/V1×100%(V1为对照组肿瘤体积，V2为实验组肿瘤体积)。
1.4.4 肿瘤细胞凋亡
肿瘤组织采用EDTA螯合法制备成单细胞悬液后PI(浓度为100mg•L-1)染色，流式细胞仪作细胞凋亡分析。
1.4.5 血清钙、磷、碱性磷酸酶及肝肾功能
摘眼球后，采血0.3mL放入采血管中离心，分离出血清用全自动血生化分析仪器检测。
1.5统计学处理
所有数据采用±s表示，数据采用SPSS 13.0统计软件进行T检验或方差分析。
2结 果
2.1 肿瘤组织病理特点
HE染色后，镜下可见：肿瘤细胞呈腺管状、实性排列，瘤内见坏死；部分肿瘤细胞有黏液变性；肿瘤细胞侵及肌肉、骨组织(图1)。免疫组化结果：TTF-1+、CK+++(强阳性)、Ki67+70%、CgA-、NSE-、CEA-。
2.2体重变化
各组裸鼠在给药前和处死前的体重情况，见表1。
由表1可见，给药前各组体重无显著性差异；处死前，中药组体重降低于模型对照组，但差异无统计学意义，而阳性组体重低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；中药组体重高于阳性药物组，差异有统计学意义(P<0.01)。
2.3 肿瘤体积及抑瘤率
根据测量肿瘤的长短径计算得出各组裸鼠肿瘤体积和抑瘤率，见表2。
由表2可见，中药组和阳性药物组肿瘤体积小于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，而且中药组肿瘤体积小于阳性药物组，差异有统计学意义(P<0.05)；中药组抑瘤率高于阳性药物组，差异有统计学意义(P<0.01)。
2.4 血清钙、磷、碱性磷酸酶
各组裸鼠血清钙、磷和碱性磷酸酶的量，见表3。
由表3可见，中药组血钙低于模型对照组和阳性药物组，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；阳性药物组血钙低于模型对照组，但差异没有统计学意义。3组血清磷比较，差异无统计学意义。中药组和阳性药物组碱性磷酸酶均低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，中药组碱性磷酸酶低于阳性药物组，差异无统计学意义。
2.5 肿瘤细胞凋亡率
各组肿瘤细胞凋亡率结果，见表4。
由表4可见，中药组和阳性药物组肿瘤细胞凋亡率高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，中药组肿瘤细胞凋亡率低于阳性药物组，但是差异无统计学意义。
2.6 肝肾功能
给药后，各组裸鼠肝肾功能的结果，见表5。
由表5可见，中药组天冬氨酸氨基转移酶高于模型对照组，差异无统计学意义，但低于阳性药物组，差异有统计学意义(P<0.01)；阳性药物组天冬氨酸氨基转移酶高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。中药组丙氨酸氨基转移酶低于模型对照组，差异无统计学意义，也低于阳性药物组，差异有统计学意义(P<0.01)；阳性药物组天冬氨酸氨基转移酶高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。中药组和阳性药物组尿素氮低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01)；中药组尿素氮高于阳性药物组，差异有统计学意义(P<0.01)。中药组和阳性药物组肌酐低于模型对照组，差异无统计学意义。
3讨 论
《灵枢•百病始生》云:“留而不去传舍于胃肠之外,募原之间,留着于脉, 稽留而不去,息而成积。”留者,瘤也。肺癌骨转移中医古代典籍未载其名，一般将其称为“骨瘤”、“骨蚀”、“骨漏疮”、“骨疽”。主要病机是肺肾两虚，瘀血阻络。自然铜：味辛苦，功能散瘀止痛，现代药理表明自然铜能提高骨折组织钙、磷水平，促进骨折愈合[6]。鹿衔草：味甘，归肝肾经，功能补虚益肾、强筋骨，现代药理研究发现鹿衔草能提高机体的免疫能力[7] 。两药合用，“一补一通”，“通补结合”很好的契合了肺癌骨转移的病机。
肺癌骨转移绝大多数表现为溶骨性骨转移。肺癌骨转移主要包括4个步骤：①肺癌细胞的脱落与外侵②肺癌细胞的趋化与迁移③肺癌细胞的黏附④溶骨性骨破坏。正常的骨骼包括两种细胞成骨细胞和破骨细胞，两者之间的平衡和耦联维持着骨代谢的平衡。在溶骨性骨破坏过程中，破骨细胞是主要效应细胞，在巨噬细胞集落刺激因子，细胞核因子KB配基受体激活剂细胞因子及骨基质生长因子的诱导激活下，导致了溶骨性骨破坏的形成。临床上常用血清钙，磷，碱性磷酸酶做为肺癌骨转移血清学指标之一[8]。
中药自然铜联合鹿衔草可以缩小肺癌骨转移裸鼠模型的肿瘤体积，提高抑瘤率，降低血清钙和碱性磷酸酶，提示二者不仅能够抑制肿瘤生长，而且可以缓解溶骨性骨破坏。二药联合可以提高瘤细胞凋亡率，提示二药的疗效机制之一是促进肿瘤细胞凋亡从而抑制肿瘤的生长。此外，通过体重、肝肾功能等比较，表明常规剂量下二药联用比较安全。
肺癌骨转移主要治疗的方法有：外科手术、局部放疗、全身化疗和二磷酸盐类药物治疗等，中医药治疗作为综合治疗的方法可以于这些方法结合，从而提高临床疗效，造福患者。
参考文献
[1] 张绍阳,余黎,肖璇,等. TNP-470对裸鼠肺癌骨转移瘤生长的影响[J] ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(1833kb)。