姜黄素对实验性变态反应性脑脊髓炎模型的干预研究(2)
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参见附件。
1.2.4病理形态观察 动物临床症状达高峰时以10%水合氯醛腹腔深麻醉后，迅速以预冷的生理盐水经左心室至升主动脉灌流至流出液为无色，断头取脑，去除大脑前部冠状切面以前的部分 (额极以上0.3cm)，然后自脑桥延髓过渡区 (延髓脑桥沟以上约0.1cm)及海马位置冠状切开大脑，放入4%多聚甲醛中固定24h以上，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，进行Luxol Fast Blue(LFB)髓鞘染色。
1.2.5 LFB髓鞘染色切片制成10μm厚，把贴有石蜡切片的载玻片放入64℃烤箱中烤片约2h。常规脱蜡至95%酒精，切片入Luxol Fast Blue染液过夜。95%乙醇洗去剩余染液，入双蒸水洗3次，0.05%碳酸锂分色15min，然后入70%酒精分化至灰白质界线分明为止，自来水冲洗不褪色，如分色不足可重复以上步骤，Hariss苏木素染色，1%的盐酸-酒精分化，氨水返蓝，乙醇稀释的沉淀酸化伊红复染，最后脱水、透明、封片，显微镜下观察。
1.3统计学处理
各组大鼠发病率采用χ2检验，潜伏期和临床评分以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用两个样本的t检验。
2 结 果
2.1 动物行为学观察
两组大鼠相继于免疫后第9～10天起开始发病，EAE组大鼠出现尾巴无力、松弛、下垂、麻痹；步履蹒跚、后肢无力、瘫痪、共济失调步态等症状，动物前行时，剑突着地，双后肢拖拉在后，趾面朝上，尾巴拖地伴有尿便失禁，于症状出现前大鼠活动减少、食欲下降乃至拒食、体重减轻、皮毛松不光滑，易激惹；与EAE组相比，姜黄素干预组大鼠症状表现轻，表现为尾巴下垂，而且很快恢复，临床症状评分与EAE组相比，差异具有显著性，发病率较EAE组略有下降，但无明显统计学差异；对照组只出现后肢肿胀、步履蹒跚，未见尾巴无力、后肢瘫痪等症状。见插页Ⅳ图1～3。各组大鼠发病率、潜伏期及症状达到最高峰时行为学改变评分变化，见表1。
2.2 病理组织学观察
在抗原注射的局部有炎症反应，EAE组大鼠组织病理切片可见脑干不同程度的炎性浸润，中心为极度扩张的血管，周围密集成袖套样形状的炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，可见大量的格子细胞，它是由小胶质细胞增生，吞噬髓鞘的破坏产物类脂质和中性脂肪而形成；神经元变性，胞体明显增大，形态圆顿，胞核偏位，核仁消失；胶质细胞增生，小结形成；LFB染色可见神经髓鞘结构松散、断裂、变薄，而轴突保存相对完整；与EAE组相比，姜黄素组脑干内未见明显炎症细胞浸润，髓鞘脱失略有减轻；对照组未见明显的病理学改变，见插页Ⅳ图4～6。
3 讨 论
MS是发生于中枢神经系统的由免疫介导的自身免疫性脱髓鞘疾病，在中青年人群中多发，具有极高的致残率，其发病可能与免疫耐受缺陷、环境触发和免疫调节异常有关，迄今尚无肯定有效的治愈办法，开发新的有效药物近年来成为研究热点。EAE作为MS的理想动物模型，不仅可研究其发病机制，而且还可用于实验性治疗和药物疗效的评价[1]。
姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种含有酚基和醌基的天然药物。传统中医认为，姜黄具有破血行气、通经止痛的功效，常常被用来治疗胸胁刺痛、闭经、癓瘕等。姜黄素作为姜黄的主要活性成分，具有显著的神经保护作用，能够抑制体内脂质过氧化反应，阻止DNA的氧化损伤[2]，刺激转录因子Nrf-2的表达[3]，抑制MAP激酶信号和影响细胞分裂周期对抗氧化的谷氨酸毒性[4]，起到抗氧化作用；通过阻止NF-κB的活化，从而抑制TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12和IFN-γ等炎症因子的产生[5]，减轻MMP-2、MMP-9的表达，促进受损血脑屏障的修复[6-7]；减轻过度氧化应激所产生的代谢物堆积[8]，抑制神经元凋亡和胶质细胞激活，改善线粒体功能缺失[9]、抑制LPS激活的小胶质细胞iNOS蛋白的表达以及NO的产生[10]等。
姜黄素具有明显的抗炎作用，在传统的中医学中，长期以来被用做治疗炎性疾病和促进创伤的愈合。近代研究表明姜黄素在一些动物模型中具有显著的抗炎作用，譬如动脉粥样硬化、阿尔茨海默病以及关节炎等。2002年Natarajan和Bright[11]首次研究发现，对于SJL/J EAE小鼠，无论是主动免疫还是过继转移，姜黄素都能明显缩短症状持续时间和减轻临床严重程度，减少炎症细胞浸润，减少IL-12产生以及Th1细胞的分化，抑制JAK/STAT通路磷酸化；Fahey AJ[12]等发现，姜黄素还能减少IFN-γ产生以及IL-12R β1、β2表达；Chearwae W[13]等发现，姜黄素能够降低CD4+、CD8+ T上TLRs4、9的表达，从而缓解临床症状；Xie L[14]等发现姜黄素能剂量依赖性的下调MBP-反应性淋巴细胞的增殖，减少IL-17、TGF-β、IL-6、IL-21等产生以及STAT3的磷酸化，从而缓解症状，改善预后。本实验研究发现，EAE大鼠经姜黄素干预后，神经功能缺损评分明显下降，体征恢复较快，未见明显炎症细胞浸润，髓鞘脱失略有减轻，提示姜黄素可能是通过减轻炎症细胞浸润，从而对EAE大鼠具有一定的治疗作用。
MS的治疗目前多采用免疫调节类和疾病修正类药物治疗，不良反应较大，严重时导致CNS内外的机会性感染，还有可能诱发肿瘤或血液系统疾病的发生。作为传统医学的中医药在改善症状和调节免疫方面可起到一定的作用，作为应用时间悠久、口服安全、价廉易得，以及具有多能性的姜黄素，在MS及其他自身免疫性疾病治疗方面具有潜在的价值，有望成为新型的治疗药物。
参考文献
[1] Steinman L, Zamvil S S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis[J] ......
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