两种子宫内膜异位症大鼠模型的血液流变学及单胺类神经递质比较研究(2)
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参见附件。
1.3动物模型的制作
1.3.1 分组及给药将42只大鼠按体重随机分为3组，每组14只：空白组，单纯子宫内膜异位症组(疾病组)，气滞血瘀子宫内膜异位症组(病证结合组)。空白组正常饲养；疾病组单纯手术移植子宫内膜；病证结合组在手术移植子宫内膜的基础上，给予多因素刺激进一步造成气滞血瘀的证候。疾病组和病证结合组于术前第5日和术后第10日开始予以灌服己烯雌酚0.02mg/kg，连续5天。术后给氨苄青霉素16万U/ kg，肌注5天。
1.3.2造模方法
(1)EMT造模方法：手术在室温23～28℃环境下进行，无菌操作，以4%水合氯醛(1mL/100g，腹腔注射)麻醉，然后将大鼠固定于手术板上，腹部剪毛，常规消毒，在尿道口上约1cm处切长1.5～2cm的纵形切口进腹。结扎局部子宫血管以及需切除的子宫上下端，切下左侧子宫长约1～2cm，立即放入PBS溶液中，修剪去子宫浆膜外的脂肪组织，纵向切开子宫腔，切取5mm×5mm长的片段，取腹壁血管丰富处，内膜层对着腹壁用5-0号丝线把四角缝合在腹壁上，使其与腹壁紧紧贴合。剩余组织进行组织学检查，以证实移植物为子宫组织，贴合位置尽量远离切口，以减少粘连并防止再开腹时损伤种植的异位内膜。向腹腔注入16万U/kg氨苄青霉素，逐层缝合皮肤和皮下组织。术后让其自然苏醒，动物分笼单放，常规饲养。建模后3周随机取3只开腹检查异位内膜成活与否。
(2)气滞血瘀证造模方法：手术后1周，腹部切口基本愈合后给予以下情志刺激：①用贴有胶布的夹子夹住动物的尾巴，使之保持激怒争斗状态，2min/次，每周1次。②用绷带细带束缚其四肢，使之行走困难，每次30min，每周1次。③食用油1mL/100g灌胃，每周1次。④皮下注射1g/L肾上腺素0.2mL/只，每周1次。以上刺激方法在1周中交替进行。
1.4观察指标及检测方法
1.4.1 大鼠血液流变学指标测定 用北京普利生仪器有限公司生产的LBY-N6K全自动血流变仪。
1.4.2 血清DA测定 多巴胺放射免疫试剂盒由北京华英生物制品研究所提供，严格按说明书操作。
1.4.3血清NE测定 去甲肾上腺素放射免疫试剂盒由北京华英生物制品研究所提供，严格按说明书操作。
1.4.4血清5-HT测定 5-羟色胺放射免疫试剂盒由北京华英生物制品研究所提供，严格按说明书操作。
1.5统计学方法
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，实验数据以(±s)表示，采用单因素方差分析及LSD检验比较各组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2结 果
2.1 HE染色结果
将造模成功的异位囊肿和在位内膜以及空白对照组的正常子宫组织按程序做成石蜡切片，HE染色后在光学显微镜下观察。异位囊肿具有与正常子宫内膜相似的结构，因为病理组织为囊状，所以多表现为一个囊腔，内层被覆腺上皮，柱状排列。正常组子宫内膜肌层厚，肌层的血管、腺体丰富，层次清晰。与正常相比异位内膜的结构不完整，肌层薄，平滑肌的环形、纵行结构不清，内膜中腺体、血管相对较少。未发现疾病组与病证结合组异位内膜有明显差异，见插页Ⅴ图1～4。
2.2各组血液流变学指标变化
病证结合模型组与单纯疾病模型组相比，全血黏度高切、中切，全血还原黏度低切、中切、高切，红细胞刚性指数，纤维蛋白原均明显增高，二者比较有统计学差异(P<0.05)；病证结合组与空白组相比全血黏度低切，血沉，血沉方程K值均明显增高，二者比较有统计学差异(P<0.05)。见表1。
2.3各组单胺类神经递质指标变化
病证结合组血清中DA、NE含量较疾病模型组高，二者有显著性差异(P<0.05、P<0.01)；而空白组血清中DA、NE含量较疾病模型组、病证结合组均高，且部分差异显著(P<0.05)；5-HT各组间无明显差异。见表2。
3讨 论
大鼠子宫内膜异位症模型的建立方法有很多种，自体移植法因为成功验证了种植学说，在实验研究中被广泛应用。这种方法主要是将大鼠的子宫内膜组织移植到腹膜、卵巢、肠系膜、皮下等部位。本实验采用腹膜移植法，因为人子宫内膜异位症好发部位在盆腔，腹腔与盆腔是相通的，腹膜处也会受到盆腔微环境的影响，这与人类子宫内膜异位症好发部位相似，并且此处血运丰富，利于移植物的生长。
血液流变学是研究血液及其有形成分的流动性、变形性和聚集性的变化规律及其在医学中应用的科学。血液粘度是表征血液流动阻力的主要参数，其高低与血液的流态密切相关。血液流变学的异常一直被认为是辅助诊断血瘀证的实验室指标之一。血液黏度是衡量血液内摩擦或流动阻力的指标，受诸多因素的影响。通常红细胞压积增加会引起血液黏度增加，且高切变率下的血液黏度反映红细胞变形程度，低切变率下的血液黏度反映红细胞聚集程度。本实验中病证结合组与空白组相比全血黏度低切，血沉，血沉方程K值均明显增高，说明病证结合组的红细胞聚集程度增高，血液粘度增加，这是血瘀证的基本表现。病证结合模型组与单纯疾病模型组相比，全血黏度高切、中切，全血还原黏度低切、中切、高切，红细胞刚性指数，纤维蛋白原均明显增高，说明经过不良因素情志刺激后病证结合组的红细胞变形程度，红细胞聚集程度较单纯疾病模型组均增加，加重了其血瘀的状态。
中枢单胺类神经递质，包括去甲肾上腺素(NE)，多巴胺(DA )，5-羟色胺(5 - HT)等。在中枢神经系统中DA起着调控情绪的作用，毛海燕等[2]观察到，在各种递质中DA的变化最为显著，并在肝郁证的形成中起着重要的促发作用。而神经内分泌学证实，5-HT与睡眠、觉醒、情绪生理反应，丘脑下部内分泌调节等机能有关，其变化反映了中枢活动状态。中医认为，肝主疏泄，条畅情志，肝与情志的关系较为密切，情志异常可导致肝气郁结，气机不畅。情志的太过与不及均能导致肝气郁滞。大鼠神经系统与人相似，具有行为情绪的变化特征[3]。有研究表明，肝郁证是在抑郁、焦虑、悲痛等不良情绪心理应激状态下，对神经内分泌、循环、消化、免疫、感觉、运动等多系统病理改变的有机概括。[4]它以高级神经中枢调节机制紊乱为前提，是一种复杂的心理活动。本研究采用多因素造模的方法，从消化、感觉、运动、神经内分泌等不同角度给予不良刺激使其心情抑郁，以达到肝郁气滞的状态。本实验中病证结合组EMT大鼠模型血清中DA、NE明显高于单纯EMT大鼠模型组(P<0.05，P<0.01)，有统计学差异。说明病证结合组经不良情志刺激后发生了神经中枢的调节机制紊乱，对情绪的调控失调而处于肝郁气滞的状态。
综上所述，病证结合组从微观表现上基本符合气滞血瘀证候。因为在疾病的发生、发展过程中，证候的属性可能会发生变化，因此模型动物证候属性的判定强调动态和全面[5]。用微观量化的指标去验证模型的证候属性具有客观性，可靠性，并且可以进行连续动态的监测，因此成为了当今研究的热点。本实验中有些微观指标无意义，甚至出现相反的结果，这可能与模型的时间窗、取材方法及指标的检测方法等有关 ......
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