电针对局灶性脑缺血模型大鼠皮层BDNF、TrkB的影响(2)
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参见附件。
1.2.2行为学检测造模后的动物在自然苏醒后，参照Longa等[7]的5级评分标准对其神经障碍进行评分。淘汰神经功能障碍在0级的动物。
1.2.3治疗方法电针组大鼠在行为学检测后立即行电针治疗。取“风府”穴 (参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》[8])，用针灸针进针4mm,接G6805-1A型电针治疗仪,选择连续波,频率为20Hz，强度以肢体抖动，且大鼠能安静耐受为度。电极连接方法：正极接风府，负极接耳朵。在每天相同时间点予以电针治疗，每天1次，每次30min，分别连续治疗3、7、14天。假手术组、模型组大鼠在相应时间点只捆绑，不针刺。
1.2.4标本采集大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4mL/kg)后，快速打开腹腔，暴露心脏，在心尖部剪一小口，将灌胃针插入左心室，剪开右心耳，快速灌注4℃生理盐水，待右心耳处流出澄清液体，换用4%多聚甲醛(pH=7.4)10mL/min灌注至大鼠四肢强直，断头取脑。选取大脑前囟前1mm至前囟后2mm区域脑组织，以确保脑梗死部位包含其中[9-10]。固定24h，脱水、透明、石蜡包埋，行连续冠状切片，片厚5μm。将切片置于37℃烤箱烘干20h，备用。
1.2.5HE染色每组取6张切片常规脱蜡水化，苏木精5min,水洗，盐酸酒精分化20s,充分水洗，弱氨水返蓝20s，充分水洗并浸泡10min，1%伊红酒精溶液染色20min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.2.6SABC法免疫组织化学染色具体步骤：切片常规脱蜡至水；0.3%H2O2室温浸泡10min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次；热抗原修复，PBS(pH7.4)洗涤2次，10min/次；滴加5%BSA封闭液，室温22℃孵育20min。甩去多余液体，不洗；入一抗(BDNF抗体浓度为1∶200,TrkB抗体浓度为1∶100)，室温22℃孵育4h，PBS(pH7.4)洗3次,2min/次；入生物素化二抗，室温22℃孵育1h，PBS(PH7.4)洗3次,2min/次；滴加SABC复合物，室温22℃孵育1h，PBS(pH7.4)洗4次,5min/次；20minDAB显色，蒸馏水洗3次，5min/次；裱片阴干，常规脱水，透明，树胶封片。对照实验：用0.01M PBS代替一抗，同步进行上述免疫组织化学染色，结果为阴性。
1.2.7细胞计数与统计从每组动物的免疫组化染色切片中，随机抽取8张，每张大鼠脑缺血部位切片随机取6个不同视野，400倍光镜下计算每个视野的阳性细胞数目，应用SPSS 16.0统计软件对相同时间段不同组样本均数之间进行单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1HE染色
假手术组在相应区域可见神经元呈层状分布，各层细胞数量较多，形态完整，神经元与周围组织间无空隙存在。模型组和电针组缺血区及缺血周围区神经元排列紊乱，细胞数量减少，缺血灶中心成堆的神经元丢失。
2.2BDNF免疫组化染色结果
光镜下观察到BDNF阳性神经元主要分布在梗死灶周围皮质部位，以神经元的胞浆内分布为多，表现为棕褐色颗粒。假手术组大鼠相应区域可见少量的BDNF表达，且强度较弱；模型组各时间点梗死周边区BDNF阳性神经元比假手术组明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，且在实验期，模型组大鼠缺血周围区BDNF阳性神经元随缺血时间延长有增多趋势，差异有统计学意义(P<0.05)；电针组3个时间点BDNF阳性神经元比相应时间点模型组显著增多，表达增强，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。
表1各组大鼠缺血区皮质BDNF
免疫阳性神经元数量(±s)
组别n3天7天14天假手术组152.44±0.362.48±0.442.44±0.48模型组147.29±1.93##11.17±1.88##15.04±2.47##电针组1411.77±3.15**17.86±4.15**23.51±5.20**F值37.8468.1780.74注：与相应时间段假手术组比较，##P<0.05;与相应时间段模型组比较，**P<005。
2.3TrkB免疫组化染色结果
光镜下TrkB的阳性神经元表现为棕褐色颗粒。假手术组大鼠相应区域可见少量的TrkB表达；模型组各时间点梗死周边区TrkB阳性神经元比假手术组明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；电针组3个时间点TrkB阳性神经元比相应时间点的模型组显著增多，表达增强，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。
表2各组大鼠缺血区皮质TrkB免疫阳性神经元数量(±s)
组别n3天7天14天假手术组152.75±0.482.65±0.652.80±0.61模型组1410.74±1.21##12.23±2.54##19.38±1.62##电针组1419.40±3.46**22.62±2.89**28.20±4.65**F值121.48157.256162.153注：##与相应时间段假手术组比较P<0.05; **与相应时间段模型组比较P<005。
3讨论
缺血性脑卒中在祖国医学中归属于“中风”范畴。其基本病机为阴阳失调，气血逆乱，上犯于脑，致脑脉闭阻而发病。“病变在脑，首取督脉”是目前治疗脑缺血疾病的主要选穴原则。风府“穴在项上入发际一寸”，是督脉与阳维脉的交会穴，《难经·二十八难》记载：“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑。”可见风府穴与脑关系非常密切，能“治脑中百病”。因此针刺风府穴可沟通阴阳，调和气血，疏通脑络，是治疗中风病行之有效的方法。
BDNF是大脑中含量最多的神经营养因子，对多种神经元的存活和生长、分化及功能的表达起着重要作用。众多的研究表明[11-13]，BDNF能保护神经元抵抗损伤，促进受损神经元的修复与再生。主要通过稳定细胞内Ca2+浓度，减少钙超载引起的损失[14]，保护受损神经元对抗NO介导的细胞毒作用，调节自由基的生成[15]，增强蛋白激酶(PKC)活性实现对脑缺血的神经保护[16]。可见，BDNF的增加可以作为一种内源性的神经保护剂来抵抗脑缺血的损伤，尤其对缺血半暗带区神经细胞的转归产生影响[17] ......
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