润喉开音颗粒对体外培养人声带小结成纤维细胞细胞周期的影响(2)
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参见附件。
1.2.3 流式细胞术观察润喉开音颗粒对声带小结成纤维细胞细胞周期的影响[5] 取已铺满平底的细胞培养瓶，弃去瓶内旧培养液，适量PBS清洗，加入0.25%胰蛋白酶2.0mL消化30s，弃去瓶内消化液终止消化，加入含15%胎牛血清的DMED完全培养液，吹打为单细胞悬液，接种于6孔细胞培养板中，每孔2.0mL，待长成单层后，用于实验。
用含15%胎牛血清的DMEM完全培养液将润喉开音颗粒、金嗓散结丸按1∶0.7稀释成所需浓度备用。
取处于对数生长期的6孔细胞培养板，弃去上清，适量PBS清洗后，将含不同浓度药物的DMEM完全培养液加入细胞培养板中，每孔2.0mL，每浓度4复孔，同时设空白对照，置37℃5% CO2培养箱中培养，48h后，收集细胞，按细胞凋亡PI染色试剂盒操作说明书操作：
(1)1×BufferA洗涤细胞一次(离心2000r/min，5min)，收集并调整细胞浓度为1×10-6/mL；(2)细胞加9倍体积的70%乙醇，于-20℃固定4h；(3)离心收集细胞后，用1×BufferA洗涤细胞除去乙醇，细胞重悬于500ulBufferA中；(4)加入RNaseA，使其终浓度为0.25mg/mL，37℃反应30min；(5)加入5μLPI染色液，室温避光染色30min；(6)流式细胞仪检测，计数10000个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析，并计算细胞增殖指数。
细胞增殖指数=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)
2 实验结果
2.1 人声带小结成纤维细胞鉴定
临床摘取人声带小结标本，组织块法进行原代培养，有活性组织块贴壁7天后有单个成纤维细胞游出并开始贴壁生长，培养14天后成纤维细胞铺满瓶底80%，倒置显微镜下观察细胞呈梭形紧密排列生长，并能顺利传代。结果见插页Ⅱ图1。
免疫组化法检测培养细胞中BEGF抗原，结果显示：培养细胞胞浆呈棕黄色着色，BFGF表达阳性。证实从人声带小结培养分离的细胞为成纤维细胞，可以用于正式实验。结果见插页Ⅱ图2。
2.2 润喉开音颗粒对体外培养人声带小结成纤维细胞细胞周期的影响
实验结果见下表所示：体外培养人声带小结成纤维细胞经润喉开音颗粒干预后，各给药组细胞处于S期的比例均较空白对照组细胞明显降低(P<0.01，P<0.05)，处于G2/M期的比例均较空白对照组细胞明显升高(P<0.01，P<0.05)。润喉开音颗粒30mg/mL及21mg/mL均能显著提高处于G0/G1期的比例，降低细胞增殖指数，与空白对照组比较具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)，表明其可以将细胞阻滞于G0/G1期及G2/M期，使DNA合成受阻，阻抑细胞的有丝分裂。提示：润喉开音颗粒对声带小结的治疗作用与阻碍细胞DNA合成、阻抑细胞有丝分裂、降低其增殖能力有关。见表1、插页Ⅱ图3。
3 讨 论
声带小结是耳鼻喉科常见病、多发病，为慢性喉炎的一种常见类型，以长期声音嘶哑伴喉部不适、干燥感，说话时有喉痛感为特征。其发病病因复杂，目前公认过强过多用声或用声不当是其发病的主要原因[1]。其病理组织学研究表明，声带小结早期声带边缘局部水肿，血管扩张，常伴有出血现象，晚期病变则呈苍白水肿样半透明或纤维增生。大量研究表明，93%的声带小结患者出现纤维性增生病变[2]。故抑制声带小结成纤维细胞增值及促进其凋亡成为治疗声带小结的靶点之一。中医药作为一种非手术的方法治疗声带小结已积累了丰富的经验，既能避免手术治疗带来的声带损伤且具有明显的治疗效果，对于声带小结的治疗有着一定的意义[6]。目前，对于中医药治疗声带小结的文献报道多以临床疗效观察为重点，利用现代医学的观点对有效地中药方剂进行客观化研究的报道还很少见。润喉开音颗粒为江苏省中医院耳鼻喉科在中医理论的指导下，根据多年临床经验，研制的纯中药制剂，治疗声带小结疗效显著。为探讨润喉开音颗粒治疗声带小结的作用机理，前期实验研究发现润喉开音颗粒可明显抑制体外培养人声带小结成纤维细胞的增值能力，并能促进其凋亡。为进一步探讨润喉开音颗粒治疗声带小结的作用机理，本次实验中观察了润喉开音颗粒对体外培养声带小结成纤维细胞细胞周期的影响。结果显示,成纤维细胞受润喉开音颗粒干预后，处于G0/G1及G2/M期细胞比例明显高于空白对照组，处于S期的细胞比例明显低于空白对照组。提示润喉开音颗粒可以将成纤维细胞阻滞于G0/G1及G2/M期，阻碍DNA合成，阻止成纤维细胞分裂，从而抑制成纤维细胞增殖及人声带小结成纤维细胞纤维化。
参考文献
[1] Karkos PD,McCormick M.The etiology of vocal fold nodules in adults[J].Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg,2009,17(6):420-423.
[2] Martins RH,Defaveri J,Custodio Domingues MA,de Albuquerque E Silva,et al ......
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