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编号:12209215
腺苷受体拮抗剂—咖啡因对CIA大鼠针刺抗炎作用的影响(2)
http://www.100md.com 2012年4月1日 柳国英,李晓佩,李方,谢文霞,叶天申
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    参见附件。

     1材料和方法

    1.1 主要药品及试剂

    咖啡因:腺苷受体非特异性拮抗剂,购自巴西Alfa Aesar公司,批号:10108515;牛Ⅱ型胶原(BcⅡ),美国Chondrex公司,货号20002-1;完全弗氏佐剂(FAC),美国sigma公司,货号F5881;血清MIF、TNF-αELISA试剂盒,美国R&B公司;TNF-α抗体,英国ABCam公司。

    1.2 主要仪器

    X线机DF-312A,切片机RM2016,低温高速离心机BECKMEN,酶标仪Bio-rad680。

    1.3 实验动物

    选用Wistar大鼠,雄性,70只,体重120~160g,来自上海莱斯科公司。SPF级环境中喂养。实验操作遵循动物使用相关伦理要求。

    1.4 实验动物造模及分组

    CIA大鼠造模方法参照文献[7]并进行改良,在无菌条件下,用0.1mol/L冰醋酸充分溶解BcⅡ,浓度为4mg/mL,置4℃冰箱过夜后,与FAC等体积混合、振荡乳化,制成BcⅡ乳剂(即每0.5mL含1mg BcⅡ)。置4℃冰箱保存备用。注射方法:大鼠适宜性喂养7天后,于大鼠颈、背部后正中线上5个部位行皮内注射,各部位0.1mL,总量共0.5mL,含1mg BcⅡ型胶原。第21天同法0.3mL加强注射。于首次注射BcⅡ乳剂后30天筛选出关节炎指数4分以上,单侧左后足外踝以下隆起的体积1.6mL以上的发病鼠40只,按关节炎指数根据随机数字表随机分为4组,生理盐水针刺组、咖啡因组、咖啡因针刺组、生理盐水对照组各10只。

    1.5 针刺及咖啡因干预方法

    针刺方法:生理盐水针刺组、咖啡因针刺组于每日9-11时间进行治疗,根据《实验针灸学》[8]大鼠穴位定位方法取穴。选取“三阴交、足三里”,穴位常规消毒,选用环球牌0.25mm×13mm针灸针进行针刺。“足三里、三阴交”(左右两侧穴位交替使用,每次取单侧)直刺5mm,每穴均匀捻转刺激30s,留针30min。每天1次,共21天。咖啡因注射:咖啡因组与咖啡因针刺组腹腔注射咖啡因(10mg/kg),生理盐水针刺组与生理盐水对照组腹腔注射等量的生理盐水,每日针刺结束后立即给药。

    1.6 X线摄片评定

    将大鼠造模前后进行 X线摄片,进行影像学鉴定。

    1.7 比较各组大鼠治疗前后的体重与足趾容积

    自备简易大鼠足爪容积测定仪,按文献[9]方法进行,结果以足爪排水体积表示。

    1.8 细胞因子的测定

    于第21天末次治疗的24h后,腹腔麻醉腹主动脉取血,离心取血清,ELISA法测定巨噬蛋白移动抑制因子(MIF)和肿瘤坏死因子因子-α(TNF-α)水平,具体操作方法按照试剂盒说明书。按文献方法[7]剥离膝关节滑膜,石蜡包埋,切片用免疫组化方法测滑膜组织的TNF-α蛋白表达水平。

    1.9 统计学处理

    采用SPSS 16.0统计软件分析,计量资料用均数±标准差表示(各组间比较列表以±s表示),多组间比较用单因素方差分析,LSD-Q检验,以P<0.05为差异有显著性差异。

    2结 果

    2.1 大鼠关节炎X线影像学改变

    造模前大鼠关节面清晰,骨质结构完整:造模后关节炎大鼠踝及跖趾关节边缘模糊甚至融合,关节间隙狭窄,软组织肿胀明显,同时新生骨增生明显,足踝关节出现骨关节强直,见插页Ⅶ图1。

    2.2各组大鼠治疗前后体重和足趾容积的变化

    2.2.1大鼠关节炎发病的一般情况初次免疫9~10天,部分大鼠踝关节开始发红,轻度肿胀。2周左右,大鼠四肢关节红肿加重,以双侧后足踝关节最为明显,足垫增厚,大鼠活动量减少,食欲下降,皮下注射部位出现多处小溃疡,随后结痂愈合。4周左右大鼠关节炎病变最为严重,活动困难,体重增长缓慢,甚至下降。

    2.2.2 免疫30天后筛选出造模成功的40只大鼠,然后按关节炎指数随机分组,测量各组大鼠治疗前体重和足趾容积。根据实验设计治疗21天后再测定体重和足趾容积。

    各组间比较:见表1、插页Ⅶ图2~3。治疗前各组大鼠体重和足趾容积均无显著性差异(P>0.05)。治疗结束后生理盐水针刺组体重明显高于其余各组,具有显著性差异(P<0.05),余各组间无显著性差异;足趾容积明显小于其余各组,具有显著性差异(P<0.05),余各组间无显著性差异。

    2.3各组血清MIF和TNF-α的表达

    生理盐水针刺组与咖啡因组、咖啡因针刺组及生理盐水对照组比较有明显差异(P<0.05),生理盐水针刺组MIF值和TNF-α值明显低于其余各组;咖啡因针刺组与咖啡因组比较有明显差异(P<0.05),与对照组比较差异也有显著性(P<0.05),MIF和TNF-α的值高于两组。见表2。

    2.4滑膜组织TNF-α的免疫组化

    在滑膜组织中TNF-α蛋白表达阳性的滑膜组织细胞浆呈橘黄色或棕黄色,每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中阳性细胞的占有率,计数10个视野,标出每个视野平均阳性细胞占有率,并按阳性细胞占有率分为5级:0,无阳性细胞;+,阳性细胞0~25%;++,阳性细胞26%~50%;+++,阳性细胞51%~75%;++++,阳性细胞76%~100%。0级定积分为0,+积分为1,以此类推。

    各组TNF-α积分比较:见图插页Ⅶ图4、表3滑膜组织TNF-α积分趋势与血清TNF-α水平相一致,生理盐水针刺组与咖啡因组、咖啡因针刺组及生理盐水对照组比较均有明显差异(P<0.05),生理盐水针刺组TNF-α积分明显低于各组;咖啡因针刺组与咖啡因组比较有明显差异(P<0.05),与生理盐水对照组比较差异也有显著性(P<0.05),其TNF-α积分均高于两组。

    3 讨 论

    RA是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病,其基本病理改变是滑膜炎和血管翳形成,与多种细胞因子作用于抗原抗体及黏附分子等一系列变化相关。其中前炎性细胞因子TNF-α对RA的发病起着中心环节的作用,根据我们以往的研究,穴位贴敷治疗的作用机制正是针对这一环节[7];而巨噬细胞移动抑制因子(MIF)以具有抑制巨噬细胞的游走及促进巨噬细胞增殖的作用而得名,被认为是TNF-α的上游细胞因子,在调控RA发病中起关键作用。近年研究表明,MIF作为一种前炎症细胞因子,可诱导巨噬细胞和活化的T细胞分泌大量的细胞因子,诱导产生环氧合酶(cycloxygenase,COX)途径的中间产物 ......

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