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编号:12209209
三七总皂苷在骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的调解作用研究(2)
http://www.100md.com 2012年4月1日 杨捷 王东
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    参见附件。

     骨髓间充质干细胞(mesemchymal stem cells, MSC)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞,对骨髓中的造血干细胞不仅有机械支持作用,还能分泌多种生长因子(如IL-6,IL-11,LIF,M-CSF及SCF等)来支持造血,并且具有向脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞等分化的能力[1-2]。目前,国内外已经有一些诱导剂可以在体外诱导MSC分化为神经元样细胞的报道[3-5],这对研究MSC的跨胚层分化的规律及基因调控机制具有重要意义。三七总皂苷(total panax notoginseng saponins, tPNS)是从三七中提取的活性有效成分,具有活血祛瘀、通脉活络、抑制血小板聚集和增加脑血流量的作用,临床上主要用于脑血管后遗症、视网膜中央静脉阻塞、眼前房出血等[6]。本研究探讨了tPNS对MSC分化为神经元样细胞的调节作用,旨为扩大三七总皂苷的临床应用范围提供理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    成年健康Wister大鼠(雌雄不限),SRF级,体质量(150±30)g,合格证:医动字021-9608;L-DMEM(Gibco公司生产)、胰蛋白酶(Sigma公司生产)以及胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)均购自杭州四季青生物材料研究所,碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰蛋白酶(Sigma公司生产)、神经元烯醇酶(neuron-specific enolase, NSE)以及胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)均购自Maxim公司,神经丝蛋白(neurofilament, NF)购自Neomaker公司。

    1.2 方法[5]

    1.2.1 MSCs的分离培养

    在无菌条件下,将大鼠麻醉后取后肢,浸泡在75%的乙醇溶液中5~8min,分离大鼠股骨并剪去两端,用L-DMEM培养液(含10%FBS)冲洗骨髓腔,收集到的骨髓细胞悬浮液用吸管反复吹打后,1500r/min离心10~15min,弃去上清液,接种于培养瓶中,37℃, 5%CO2培养箱中进行原代培养。培养第5天进行半量换液,以后每隔3天进行全量换液。10~14天后细胞接近融合,采用0.125%的胰酶进行消化传代。

    1.2.2 tPNS诱导MSCs分化为神经元样细胞

    MSCs传至第5代后,按2×105/L的密度接种于6孔板上,当细胞达到80%融合时,弃去培养液,用完全培养液(含10μg/L bFGF)进行预诱导24h,并用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7.3)冲洗3次,之后,采用无血清培养液(含三七总皂苷0.25g/L)进行诱导。对照则不加任何诱导剂,用完全培养液继续进行培养。

    1.2.3 诱导细胞的鉴定

    采用含2.5g/L的tPNS无血清培养液诱导细胞5h后,用40g/L的多聚甲醛在4℃固定30min,磷酸盐缓冲液冲洗3次后,采用免疫组织化学SABC法检测NF-M、NSE、nestin、MAP-2、生长相关蛋白43(GAP-43)以及GFAP的表达。对照不加一抗。经DAB显色后,随机选择10个非重叠视野(×100),计算NSE和MAP-2阳性细胞占总细胞数的比例,结果采用均数±标准差(±s)的形式表示。

    2结 果

    2.1 诱导细胞的鉴定

    采用tPNS对MSCs进行诱导后,20min~4h大多数MSCs呈神经元样细胞分化。经免疫组织化学鉴定,上述细胞呈棕黄色,NSE、MAP-2和NF染色阳性,而GFAP染色阴性,对照则无阳性细胞产生。

    2.2 诱导为神经元样细胞的形态变化

    采用含bFGF的完全培养液预诱导MSCs 24h后,细胞形态改变并不明显,均呈梭形。但当采用tPNS诱导30min~5h,MSCs的胞体逐渐增大,并伸出细长的突起,在突起的末端出现分支,有些相邻细胞的突起成网状连接。对照细胞仍呈长梭形,形态变化不明显。

    2.3 免疫组织化学鉴定

    tPNS诱导MSCs转变为神经元样的形态,经免疫组织化学鉴定,大多数细胞表现为NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43染色阳性,并在胞质和突起中有棕黄色的物质。而GFAP染色均为阴性。对照细胞的胞质中无棕黄色物质。tPNS诱导MSCs转变为神经元样细胞,SABC法显示NSE和MAP-2阳性细胞数分别为(72.64±2.04)%和(73.57±2.17)%。

    3讨 论

    骨髓原始间充质干细胞向多种细胞,特别是向神经样细胞的分化一直是国内外的研究热点。有学者报道,采用含DMSO和BHA的无血清L-DMEM即可诱导MSCs分化为神经元样细胞。诱导后,神经元样细胞NSE和NF-M表达阳性,而GFAP表达阴性。但国内外不同的研究者采用不同的方法获得的结果并不完全相同。

    抗氧化剂是目前为止主要的诱导MSCs向神经元样细胞分化的诱导剂,关于其作用机制目前还有争议,可能与抗氧化剂的清除羟自由基和超氧阴离子的作用有关。Makino等[8]首次报道了MSC可在体外诱导剂5-氮胞苷作用下转化为心肌样细胞,此后,国内外出现了许多相继的研究报道。我国项鹏等[9]的研究表明,丹参注射液在体外具有诱导人MSCs分化为神经元样细胞的作用,其机制可能与丹参的抗氧化作用有关。项平等[10]研究表明,更换成含tPNS 0.25g/L的无血清培养液后,细胞内荧光强度逐渐增加,到100s时达高峰值,其后逐渐减弱,但诱导20min时,细胞的荧光强度仍高于诱导前,此时MSCs开始向神经元样细胞分化。

    bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽,可影响中胚层和神经外胚层细胞的增殖和分化。本研究采用含bFGF的完全培养液进行预诱导,使细胞处于较佳的增殖状态,而细胞的形态呈长梭形,无明显改变。NSE是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种,存在于神经组织和神经内分泌组织中。NSE在脑组织细胞的活性最高,外周神经和神经分泌组织的活性水平居中,最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。它被发现在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤中,特别是SCLC中有过量的NSE表达,导致血清中NSE明显升高。

    本项目结果显示,tPNS能诱导MSCs转变为类似于神经元样的形态,经免疫组织化学鉴定,大多数细胞表现为NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43染色阳性,并在胞质和突起中有棕黄色的物质。SABC法显示NSE和MAP-2阳性细胞数分别为(72.64±2.04)%和(73.5±2.17)%。提示三七总皂苷在体外能使MSCs向神经元样细胞转化,且具有神经元样细胞的特性,这为MSCs治疗相关疾病提供了理论基础。

    参考文献

    [1] Martin DR, Cox NR, Hathcock TL, et al. Isolation and characterization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow[J] ......

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