DNA甲基化抑制物对雌激素受体β在乳腺癌细胞中表达的影响及意义(1)
【摘要】目的：研究甲基化抑制物作用于乳腺癌细胞后对其ER-β表达的影响及意义。方法：抽取细胞总RNA，采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MCF-7与MDA-MB-231中ER-β的表达状况。在两种细胞中按作用浓度加入甲基化抑制药物5-AZA-CdR，反应一定时间后用RT-PCR的方法测定药物处理后ER-β的表达情况，分析影响及意义。结果：MCF-7的ER-β平均表达水平(0.54±0.44)，药物处理后平均表达水平(0.76±0.53)，较未经药物处理的细胞明显升高(P1.8者为理想,各取2 μl mRNA 做逆转录成cDNA。逆转录条件: 5×逆转录反应缓冲液 4 μl，10 mmol/ L dNTP 2 μl,Olig(DT)18primer 1 μl, RNA酶抑制剂(Ribolock Ribonnclease inhibitor) 1 μl, Aid 逆转录酶 1 μl，加无核酸酶水至终反应体系20 μl，70 ℃变性5分钟，37 ℃孵育5分钟,42 ℃ 60分钟，70 ℃ 10分钟。反应完毕后取出,冰上放置5分钟，将生成的cDNA 置于- 20 ℃保存。Primer-5设计引物参照文献设计合成，ER-β上游引物序列5'-TGCTCCTGGCAACTACTTCA-3',下游引物序列5'-GACAGGAGCATCAGGAGGTT-3'。 内参照β-actin 上游引物：5'GGACCTGACTGACTACCTA 3'，下游引物: 5'TCATACTCCTGCTTGCTG 3'。在MDA-MB-231和MCF-7的培养瓶中按10ml培基各加入终浓度为5 Mm的5-AZA-CdR原液5μl使得培养瓶内的药物浓度为2.5 μmol/L，48小时后抽取药物干预后的细胞总RNA并将其逆转录成cDNA -20℃保存，方法同前。1.3 ER-β的PCR反应条件：95 ℃预变性5分钟, 95 ℃变性1分钟, 57 ℃退火1分钟,72 ℃延伸1分钟, 共35 循环, 72 ℃延伸10分钟。取目的基因和内参基因的PCR产物各4 μl与载样液混和后(按4∶1)，分别加入2%琼脂糖凝胶电泳检测并照相保存,各目的基因扩增重复3~5次，取均值。在图像分析系统上观察分析，用平均吸光度乘以条带面积的值表示总的吸光度值，代表各基因的mRNA量。以目的基因与内参基因的A 值的比值表示ER-βmRNA的相对表达水平。, http://www.100md.com(陈 渡 钱立元 霍志军)