猪血中高纯度血红素的提取工艺(1)
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【摘要】目的：确立最佳溶血方法，建立高产量、高纯度血红素提取工艺。方法：新鲜抗凝猪血为原料，比较了水溶胀法、乙醇法以及超声波法对红细胞溶血效果，以盐酸丙酮配比，盐酸丙酮与溶血液体积比对猪血中血红素提取的影响。结果：确立超声波法进行红细胞溶血，36.5%浓盐酸与丙酮的体积为1%的血红素抽提液，与溶血液的体积比为5∶1抽提10分钟，最终可从新鲜猪血中得到红素6.0 g/L，纯度达99.8%。结论：用超声法溶血效果明显优于水溶胀法、乙醇法，溶血率达100%；36.5%浓盐酸与丙酮的体积比为1%的血红素抽提液，有利于规模化生产。
【关键词】猪血；血红素；超声波溶血；提取
文章编号：1009-5519(2007)18-2687-03 中图分类号：R9 文献标识码：A
Extraction of heme from porcine blood
, 百拇医药
LIU Ren-min1，FAN Wan-dong2，WANG Yao-feng1，et al.
(1.College of Life Science and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology， Nanjing 210009，China；2.Nanjing veterinary station， Nanjing 210001，China)
【Abstract】Objective:To determine the best method of hemolysis and establish a high-yield,high-purity heme extraction technology.Methods:The fresh porcine blood added sodium citrate was used for extracting of heme. The methods of hematolysis by water,ethanol and supersonic wave were compared.And the effect of the percentage of hydrochloric acid to acetone,the volume ratio of hydrochloric acid acetone to hematolysis solution were researched.Results:The supersonic wave hemolysis was Established.The optimum conditions for extracting heme were that 1% hydrochloric acid (the level of 36.5%) in acetone to hematolysis solution at the volume ration of 5∶1 (V/V) and time for 10 min.The yield of heme was up to 6.0 g/L and the purity 99.8%.Conclusion:The supersonic wave was better than water and ethanol for hematolysis and hemolysis ratio was 100%;1% hydrochloric acid (the level of 36.5%) in acetone to extract heme is favor of industrial production.
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【Key words】Porcine blood;Heme;Hematolysis by supersonic wave;Extraction
探索酸性丙酮提取法制备血红素工艺中溶血方法、酸性丙酮及其与溶血液的比例对提取的影响，特别是超声波溶血与丙酮提取方法相结合，建立了快速、简便制备高产量和高纯度血红素的新工艺，为规模化生产提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器：原材料：新鲜猪血，南京肉联厂提供。试剂：血红素标准品(Sigma公司)，其他试剂均为分析纯。主要仪器与设备： UV-8500型分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程：新鲜抗凝猪血→离心→红血球→洗涤→溶血→加酸性丙酮于溶血液→抽提得血红素溶解液→滤液→真空浓缩→氢氧化钠纯化→干燥得血红素。工艺要点：新鲜猪血加8 g/L柠檬酸三钠为抗凝剂，5 000 r/min，离心15分钟，收集红细胞，再用0.9%氯化钠溶液洗涤红细胞1次。抽提后的血红素溶液采用真空浓缩并回收丙酮。浓缩物采用0.1 mol/L NaOH溶解，3 000 r/min，离心10分钟收集上清液。以1 mol/L盐酸调解pH值至4～5，沉淀血红素，收集沉淀并水洗至中性，50 ℃真空干燥至恒重得血红素。
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1.2.2 溶血方法的比较：(1)水溶胀法：取25 ml红细胞，按照去离子水与红细胞溶液体积之比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、 3.0∶1，6个水平以400 r/min转速搅拌不同时间，用血球计数板计数红细胞破碎数量，比较溶血率。
(2)乙醇溶血法：取25 ml红细胞，按照95%乙醇体积占红细胞溶液体积的10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%7个水平以400 r/min转，速搅拌30分钟，比较溶血率。同1.2.2中(1)的方法。(3)超声波溶血法：取25 ml红细胞，加入0.5倍体积去离子水，用冰水浴在功率100W，200W，300W，400W，500W 5个水平下超声10分钟，比较溶血率。同1.2.2中(1)的方法。
1.2.3 酸性丙酮溶液中浓盐酸与丙酮体积比的确定：(1)按照1.2.2中(3)的方法处理的红细胞溶血液，按酸性丙酮溶液与溶血液体积比4∶1的比例加入红细胞溶血液抽提10分钟，比较36.5%浓盐酸与丙酮体积比为0.5∶100、1∶100、 2∶100、3∶100、4∶100、5∶100 5个水平的酸性丙酮溶液抽提效果。抽提液经过滤、浓缩、纯化、干燥后计算每升猪血中血红素的提取量(g/L)。
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1.2.4 抽提时间的确定：取按照1.2.2中(3)的方法处理的红细胞溶血液，按1.2.3方法确立的最佳条件加入4倍于溶血液体积的1%酸性丙酮(36.5%浓盐酸与丙酮的体积比)，分别抽提4、6、8、10、12、14分钟。过滤、浓缩、纯化、干燥后计算每升猪血中血红素的提取量(g/L)。
1.2.5 酸性丙酮与溶血液不同体积比对血红素抽提的影响：为了确定酸性丙酮与溶血液体积比，取按照1.2.2中(3)的方法处理的红细胞溶血液，按照酸性丙酮溶液与溶血液体积比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1比例混合， 进行抽提，抽提时间按照1.2.4方法确立的最佳时间。同1.2.3测定血红素提取量(g/L)。
1.2.6 血红素的纯化：将真空浓缩物用0.1 mol/L NaOH溶液溶解后离心，取上清液，以1 mol/L盐酸调解pH值至4～5，沉淀血红素，收集沉淀并水洗至中性，50 ℃真空干燥至恒重得血红素。, 百拇医药(刘任民 范万东 王摇风 陆利霞 熊晓辉)