HPV16的新型伪病毒对DNA特异性B细胞的靶向实验研究(1)
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【摘要】目的：构建人乳头状病毒( human papilloma virus，HPV) 16型的新型伪病毒，并检测其对DNA特异性B细胞(R4A)的靶向性。方法：利用昆虫杆状病毒表达系统表达病毒蛋白，在体外变性与复性过程中将病毒蛋白包装绿色荧蛋白EGFP表达型质粒，形成伪病毒。透射电镜观察病毒样颗粒( virus-like particle， VLP)的结构，并转染R4A细胞，荧光显微镜和流式细胞仪检测其转染效率。结果：透射电镜观察证实病毒蛋白可自我组装成VLP，在转染R4A细胞后，荧光显微镜和流式细胞仪成功检测到荧光的表达。结论：HPV16的新型伪病毒能成功转染R4A细胞，为系统性红斑狼疮(SLE)的靶向治疗提供了理想的策略。
【关键词】人乳头状瘤病毒16型；伪病毒；靶向性
文章编号：1009-5519(2008)11-1581-02 中图分类号：R37 文献标识码：A
系统性红斑狼疮(SLE)主要是由多克隆自身反应性B细胞介导的自身免疫性疾病，其直接的致病因子是多克隆自身抗体，并以免疫复合物的形式造成多种组织器官损伤。抗双链DNA抗体不仅具有诊断学价值，而且是触发SLE的主要致病性抗体[1，2]。作为抗双链DNA抗体来源的DNA特异性B细胞，在SLE发病中扮演关键角色[3]。目前临床上主要使用糖皮质激素及其它广谱免疫抑制剂防治SLE，但是不良反应明显，效果有限。因此寻求新的治疗手段成为临床上的迫切需求，以DNA特异性B细胞为靶标的干预治疗策略现已成为学者们探索的热点[4，5]。
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最新研究表明人类乳头状病毒16型(Human Papillomavirus type-16，HPV16)的主要衣壳蛋白(L1)具有自身装配成病毒样颗粒(Virus-like Particles，VLP)的特性，HPV16 L1还能将外源DNA分子包装成伪病毒，具有高效的细胞转染活性[6]。另外Gaynor等[7]以抗ds-DNA抗体为亲和配基，从噬菌体随机肽库中筛选得到了多个表位肽，可模拟DNA分子与抗ds-DNA抗体结合。其中一个序列为DWEYSVWLSN的10肽(我们命名为PD肽)，与ds-DNA抗体有高亲和力。因此PD肽在理论上可用来引导融合蛋白或基因载体对DNA特异性B细胞进行杀伤或干预。根据以上发现，我们选择绿色荧光蛋白EGFP表达型质粒与包含PD肽的病毒蛋白HPV16 L1包装成新型伪病毒。研究用透射电镜观察病毒样颗粒的结构，并转染R4A细胞，荧光显微镜和流式细胞仪检测其转染效率。我们希望该伪病毒能具有很好的靶向活性，为SLE的高效治疗提供理论依据。
1 材料与方法
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1.1 材料
1.1.1 细胞株：dsDNA特异性B细胞杂交瘤细胞(R4A)由美国Putterman教授惠赠，小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0)，小鼠T淋巴瘤细胞(EL-4)由本研究所保存。
1.1.2 质粒、菌株和衣壳蛋白：绿色荧光蛋白EGFP表达型质粒为本研究所保存。HPV16 L1委托上海生工表达并纯化。
1.1.3 主要试剂：细胞培养基RPMI1640购自GIBCO公司，小牛血清购自华美公司。
1.1.4 主要仪器：流式细胞仪，FACS Calibur型， BD公司。荧光显微镜NikonTE-2000。
1.2 方法
1.2.1 伪病毒的构建：将纯化的HPV16 L1 1 mg于1 ml的PBS中溶解。溶解后的蛋白溶液在终浓度为5%的2-巯基乙醇中变性，4 ℃，16 h。在变性的蛋白溶液中加入2 mg的表达质粒。并将变性蛋白与质粒的混合物放于透析带中，在PBS溶液中于4 ℃透析过夜，使变性蛋白逐渐复性。
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1.2.2 透射电镜观察实验：将新鲜制备的疫苗滴于200目铜网上，吸附3 min。吸水纸吸干，晾干 30 s。以1%质量体积分数的水溶性醋酸铀负染30 s，吸水纸吸干， 晾干30 s。80 kV透射电镜观察。
1.2.3 细胞转染实验：6孔板中用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养R4A、SP2/0、EL-4，培养至融合率为50%时，加入伪病毒15μl，继续培养48 h。
1.2.4 细胞转染检测实验：转染的各组细胞于荧光显微镜下观察荧光情况，并用流式细胞仪检测转染效率。
2 结果
2.1 透射电镜观察结果：L1具有自我组装成颗粒样结构的特性。在变性剂2-巯基乙醇的作用下，L1解离成细小的分子结构，并在PBS溶液中能逐渐复性，恢复成为原来的颗粒样结构。在该过程中，L1能充分包装质粒分子，形成模拟病毒样结构的伪病毒，见图1。
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2.2 荧光显微镜观察结果：实验用荧光显微镜观察伪病毒对R4A细胞的靶向转染能力，实验结果见图2。在转染48 h后，荧光显微镜检测到伪病毒转染R4A组中的细胞内有绿色荧光蛋白的表达，伪病毒转染SP2/0和EL-4对照组中的细胞内只有微量绿色荧光蛋白的表达。
2.3 流式细胞仪检测结果：实验用流式细胞仪检测伪病毒对R4A细胞的靶向转染百分率，实验结果见图3。在转染48 h后，荧光显微镜检测到伪病毒转染R4A组中的荧光阳性百分率为41.62%，伪病毒转染SP2/0组中的荧光阳性百分率为1.37%，伪病毒转染EL-4组中的荧光阳性百分率为1.64%。
3 讨论
SLE是一种潜在致命的自身免疫性疾病，其致病因素多，发病机制复杂，引起肾脏和神经系统等多器官、系统损害，已经严重危害着人类的健康。目前对 SLE的发病分子机制还不完全清楚。在SLE患者体内能检测到许多自身抗体，包括循环抗体和可能来源于凋亡细胞及坏死细胞的双链DNA抗体。免疫复合物沉积在各个器官的血管壁，诱导微血管损伤，同时伴有血栓形成和炎症表现，引起血管炎，导致心、肺、肾等重要器官组织的严重并发症[8]。
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目前临床上主要使用的免疫抑制剂不良作用明显、效果局限，因此科研工作者已将目光转向能特异靶向DNA特异性B细胞的治疗策略，希望能通过特异靶向杀伤DNA特异性B细胞，降低dsDNA抗体滴度，从而达到控制或治疗SLE的目的。当前的治疗策略有干扰DNA特异性B细胞的活化，重组免疫毒素杀伤病理性B细胞等。但是以上方案存在着体内易降解，其血清半衰期短，其它细胞吞噬后可能造成非特异性损伤，可能诱发机体的免疫应答等不足。因此容忍了病理性B细胞克隆的持续存在，而且其治疗效果不太稳定和持久。
最新有研究发现一种能模拟天然病毒结构的转染系统能够有效转染细胞，并介导基因的成功表达。由于该系统具有天然病毒的结构，所以被科研人员命名为“伪病毒”。研究证明在众多表达系统中，伪病毒具有以下特点：(1)在自然环境中并不存在，而是完全源自人工设计、构建，并且可以优化改造；(2)“病毒基因组”比较简单，不含自我复制或潜在的致癌序列，较其它病毒载体更安全；(3)病毒衣壳免疫原性弱，仅诱导机体微弱的体液免疫和细胞免疫应答，特别是产生的中和性抗体滴度很低。因此，基于上述的成熟理论和安全可靠的方法，本研究选择伪病毒的形式来探索对DNA特异性B细胞的作用。实验将多价串联PD肽插入到HPV16 L1中，构建暴露PD肽的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16 L1-PD，并结合绿色荧光蛋白表达质粒，制备模拟天然病毒样结构的伪病毒，希望该伪病毒能高效特异地靶向dsDNA特异性B细胞杂交瘤R4A。透射电镜证明，在自然状态下L1具有自我组装成颗粒样结构的特性。在变性剂2-巯基乙醇的作用下，L1解离成细小的分子结构，并在PBS溶液中能逐渐复性，恢复成为原来的颗粒样结构。在该过程中，L1能充分包装质粒分子，形成模拟病毒样结构的伪病毒。在转染细胞实验中，荧光显微镜和流式细胞仪检测观察到该伪病毒疫苗能高效转染R4A细胞，并介导绿色荧光蛋白的表达，而对照组细胞SP2/0、EL-4几乎没有绿色荧光蛋白的表达。, 百拇医药(杨 曌 王惠明)