羊水细胞培养及染色体制备方法的探讨
 |
【摘要】目的：探讨羊水细胞培养及染色体制备方法。方法：孕15~29周具有产前指征的50例孕妇，抽取羊水细胞培养6~7天，换液第二天取出观察，见有许多大而亮圆的分裂期细胞时，加入秋水仙素继续培养1小时后收获、低渗、固定、制片、消化、染色。结果：50例羊水细胞培养全部成功，成功率100%。有49例获得满意的染色体分裂相。结论：该方法细胞培养成功率高、有效分裂相多、实验稳定、易于操作、成功率高。
【关键词】羊水细胞培养；染色体制备；方法
文章编号：1009-5519(2008)15-2221-02 中图分类号：R71 文献标识码：A
羊水细胞培养及其染色体制备技术是胎儿染色体病产前诊断的重要手段。由于羊水细胞培养技术要求高、羊水中活细胞少、培养周期长、易污染、分裂相少；细胞收获、低渗、固定、显带、染色诸多环节，相对于外周血染色体的制备，羊水细胞染色体制备的难度较大，任一环节不合适都可能导致失败。针对上述情况，借鉴国内外的一些经验[1~5]，我们摸索出了一种简便、易行，提高羊水细胞培养及染色体制备成功率的方法，收到良好效果，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料：(1)标本来源：选择来我院遗传门诊咨询的15~29孕周，年龄25~45岁疑有染色体病胎儿的孕妇50例，其中产前筛查后，风险率大于1/270的40例，年龄大于35岁的孕妇10例。(2)培养器皿：CO2培养箱，纯度99.99%的CO2，25 ml培养瓶(CORNING，型号：3289)，离心机，倒置显微镜等。(3)试剂：羊水培养基购自浙江贝因美公司。20 ?滋g/ml的秋水仙素，1%的柠檬酸三钠，0.075 mmol/L的KCl，0.25%的胰蛋白酶，固定液由甲醇与冰醋酸按3∶1比例配成。
1.2 方法
1.2.1 标本采集：嘱孕妇平卧在手术床上，让其左右翻身10次左右，以使羊膜腔内脱落的细胞悬浮，在B超引导下，用7号穿刺针经腹抽取羊水，先用5 ml注射器抽出2 ml羊水丢弃，再换用20 ml注射器抽取羊水20 ml，并迅速送到无菌间。
, 百拇医药
1.2.2 羊水细胞培养：(1)细胞收集：在生物安全柜内，将羊水注入2只15 ml无菌离心管中，每只10 ml，1 000转/分，10分钟，弃上清，留0.5 ml，用无菌吸管轻轻吹打混匀。(2)接种：将混匀的羊水细胞接种于2个25 cm2细胞培养瓶中，每瓶加入5 ml羊水培养液，轻轻混匀。(3)培养：酒精灯过火瓶口，拧紧瓶盖卧式静置于CO2培养箱中，温度37 ℃，CO2浓度5%，培养6~7天后观察细胞贴壁及生长情况。(4)细胞培养情况观察：细胞培养6~7天后方可在倒置显微镜下观察。此时，可见瓶底贴壁细胞已形成6~10个克隆，可换液。无菌操作将瓶内液体收集于1个15 ml无菌离心管，重新加入4 ml羊水培养液，继续培养1~2天，镜下可见较多大而亮圆的分裂期细胞，可终止培养进行收获。换液时换下的培养液可重新离心后将细胞接种于一个25 cm2的培养瓶内继续培养，在培养6~8天后仍会有新的细胞贴壁，并形成克隆，能有效防止第一次羊水细胞收集及染色体制备失败。(5)终止培养：每瓶加秋水仙素(20 ?滋g/ml)40 ?滋l，旋紧瓶盖37 ℃继续培养1小时。
, 百拇医药
1.2.3 羊水细胞收获：将羊水细胞培养液倒入一个干净离心管中，用吸管吸干净，快速将37 ℃温浴(30分钟以上)的0.25%的胰蛋白酶和1%的柠檬酸三钠1∶9混合液1 ml加入培养瓶中，轻摇培养瓶，使消化液与培养瓶底面充分接触，立即放回37 ℃培养箱中温浴0.5~1分钟，取出培养瓶，将上述离心管中的培养液倒入培养瓶中，轻摇培养瓶，终止胰蛋白酶的消化作用，用细胞刮片轻轻刮下细胞。用吸管将培养瓶中的细胞转移到离心管中，1 000转/分，离心10分钟，弃上清，保留细胞沉淀。
1.2.4 低渗：加入37 ℃预温30分钟以上的0.075M KCl低渗液7 ml，用吸管轻轻吹匀细胞，使细胞悬浮于低渗液中，放回37 ℃温浴箱中，静止30分钟。
1.2.5 预固定：沿管壁缓慢加新鲜固定液(冰醋酸∶甲醇=3∶1)1.5 ml，用气泡轻轻吹打溶液使其混匀；1 000转/分，10分钟。然后吸弃上清液，保留沉淀。
, 百拇医药
1.2.6 固定：沿离心管壁加入新鲜固定液5.5 ml，用气泡吹匀，继续固定30分钟。1 000转/分，离心10分钟。弃上清液，保留沉淀。
1.2.7 再固定：再加入新鲜固定液5.5 ml，用气泡吹匀，静止30分钟。1 000转/分，10分钟。弃上清，保留沉淀。
1.2.8 3次固定：加入新鲜固定液0.5 ml制成细胞悬液。
1.2.9 滴片、烤片和显带：用滴管吸细胞悬液2~3滴，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，并在酒精灯的火焰下过火几次，置75~80 ℃烤箱中烤片2小时。用预温15分钟的0.01%的胰蛋白酶消化25~30秒，Giemsa染色液染色10分钟。
2 结果
2.1 羊水细胞生长情况：实验结果显示，50例孕妇羊水细胞培养均获得成功，成功率100%，其中2例血性羊水细胞培养也获得成功。
, http://www.100md.com
2.2 羊水细胞收集及染色体制备：实验结果显示，50例孕妇羊水细胞培养通过细胞收集及染色体制备，有49例获得满意的染色体分裂相，成功率98%，见图1和图2。
3 讨论
羊膜腔穿刺技术具有一定的创伤性，一旦失败孕妇难以接受再次穿刺。在实际工作中，影响羊水细胞培养及染色体制备成功率的因素很多[6，7]。实验结果显示，虽然50例羊水细胞培养均获得成功，但在细胞收获、制片、消化、显带等环节上有1例出现问题，导致结果分析失败。说明羊水细胞培养在加秋水仙素的时机、细胞收获、低渗、固定、显带、染色等环节，也非常重要。在实验中对以下环节进行了改进和优化，取得了满意效果。
3.1 羊水细胞培养的环境
3.1.1 细胞培养瓶：使用CORNING 3289型细胞培养瓶，细胞易于贴壁，快速生长。
, 百拇医药
3.1.2 在实验中，使用纯度为99.999%的高纯CO2，细胞生长旺盛、舒展，在培养至第七天时，形成多个克隆。我们认为高纯度的CO2有利于羊水细胞的生长。
3.1.3 收获时机的掌握非常关键：我们在换液后第二天，低倍镜下见到5~10个细胞克隆，克隆中央基本无细胞老化，且细胞大而亮圆，有比较多的双核细胞，即进行收获。我们发现培养时间越长，细胞越易老化，不宜收到较多的分裂中期的细胞。并不是细胞生长的时间越长、细胞越多获得的中期细胞就越多。如果发现细胞老化的太多，可进行传代培养。
3.1.4 秋水仙素的浓度：加秋水仙素的终浓度为0.20 ?滋g/ml，置37 ℃继续培养1小时，获得的染色体长短适中，易于分析。
3.1.5 收获时消化液的选择：采用1%的柠檬酸三钠于0.25%的胰蛋白酶1∶9混合。消化时间短，仅需1~2分钟即可。柠檬酸三钠能使细胞连接松散，易于吹打成单个细胞，易于进行低渗。
, 百拇医药
3.1.6 滴片：用滴管吸细胞悬液2滴，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，使细胞平铺于载玻片上，并在酒精灯的火焰下通过几次。载玻片过火可使染色体散开，便于找到好的染色体分裂相。
参考文献：
[1] 刘晓翌，肖晓素.羊水细胞染色体制备方法的研究[J].中国妇产科临床杂志，2004，5(4)：296.
[2] 鲁莉萍，陈意振，张莉超.羊水细胞培养在产前诊断中的应用619例染色体核型分析[J].中国优生与遗传杂志，2005，13(5)：32.
[3] 曾爱群，陈全娘.改良羊水染色体的制备技术[J].广州医学院报，2001，29(4)：42.
[4] 孙明强，徐继秀.提高羊水细胞培养成功率的方法[J].中国优生与遗传杂志，2007，15(6)：45.
, http://www.100md.com
[5] Priest RE，priest JH，Moinuddin JF，et al.Differention in human am-2niotic cell cultures：chronic gonadotropin[J].In Vitro，1979，15:142.
[6] 许争峰，胡娅莉，朱瑞芳.高效羊水细胞培养技术在产前诊断中的应用[J].中华妇产科杂志，2006，41(4)：275.
[7] Turhan N0，Eren U，Seckin NC. Second-trimestergenetic amnio cente-sis:5-year experien[J].ArchGynecolObstet，2005，271：19.
收稿日期：2008-03-27, 百拇医药(韩兆东 阮月芹 杨延冬 孔祥华 郑 静)