影响乙型肝炎表面抗原在ELISA检测中的2种因素分析
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【摘要】目的：探讨乙型肝炎表面抗原在ELISA法检测中受溶血标本、洗涤过程影响而使检测结果产生异常的分析。方法：在应用ELISA酶免疫一步法对乙型肝炎表面抗原进行检测的过程中采用以上影响因素进行检测，再与其正常结果加以对照分析。结果：乙型肝炎表面抗原受上述因素影响后易产生假阳性或假阴性的结果。结论：如何避免以上因素对乙型肝炎表面抗原检测结果的影响，这就要求对实验条件、操作规程、试剂与仪器、实验人员的操作水平等进行严格的质量控制，对于已溶血的标本不能使用。
【关键词】溶血；乙型肝炎表面抗原；ELISA酶免疫一步法；手工洗板法
文章编号：1009-5519(2008)16-2493-02 中图分类号：R446 文献标识码：B
在临床及健康体检工作中，人们对乙肝两对半的检测已成为重要项目。HBsAg是机体感染HBV后最先出现的血清学指标物，HBsAg阳性可见于急性乙型肝炎患者的潜伏期、急性期、慢性乙型肝炎患者、无症状HBsAg携带者，所以HBsAg是HBV重要的感染指标之一。用ELISA一步法检测HBV血清学标志物来诊断乙型肝炎和观察治疗效果是临床工作中常用的方法，其原理是采用单克隆抗-HBs 包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBs-HRP(辣根过氧化酶)的酶液，当标本中存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB(四甲基联苯胺)底物产生显色反应，反之则无显色反应。但在具体实践工作中，有时会遇到HBsAg检测结果前后不一致或与其他单位的检测结果不一致的情况，其原因是多方面的。本文就实际操作中的2种影响因素加以分析。
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1 溶血对HBsAg检测结果的影响
1.1 试剂：酶联免疫试剂盒由北京万泰公司提供。
1.2 标本：HBsAg阴性标本137例、HBsAg强阳性标本68例、HBsAg弱阳性标本68例的非溶血和溶血血清(清洁玻璃棒搅拌使其溶血)各1份。
1.3 方法：参照《全国临床检验操作规程》用ELISA酶免疫一步法，严格按照试剂盒说明书进行操作，用酶标仪单波长(450 nm)测定，设空白对照孔，测定各标本OD值。
1.4 统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件包分析，运用配对设计t检验。
1.5 结果：95例HBsAg阴性标本和47例HBsAg强阳性标本，非溶血和溶血血清检测结果(阴性或阳性)全部一致；47例HBsAg弱阳性标本，溶血血清检测出现4例假阴性，结果见表1。
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2 ELISA法测定HBsAg手工洗板法对阴性标本结果的影响
2.1 方法：实验方法用阴性标准血清，按试剂盒说明书严格操作，进入洗板程序时分别进行如下几类操作：(1)用较低浓度的洗涤液洗板(1∶40稀释的洗涤液)，其它洗板过程均严格操作。(2)洗板次数减少(1～2次)，其它洗板过程均严格操作。(3)洗涤液泡板时间缩短(1～2秒)，其它洗板过程均严格操作。(4)洗完板后，没有将板上的残液拍净，其它洗板过程均严格操作。(5)按试剂盒说明书严格操作洗板(用1∶20稀释后的洗涤液洗板，洗涤液注满各孔，静置20秒，除去洗涤液，重复3~5次后拍干残液)。如果标本量很少，洗板时静止浸泡的时间一定要足够，必要时可以多洗两遍，这样也可以杜绝“花板”现象的发生。
2.2 结果：见表2。
3 讨论
3.1 溶血是由于红细胞破裂引起的，主要有体外溶血和体内溶血两种：体外溶血可由物理因素(如机械性破坏、冰冻)、化学因素(如血样接触表面活性剂)和代谢性因素(如遗传病引起的血细胞脆性增加)引起；体内溶血则可由物理因素(人工心脏瓣膜或大血管手术后)、生物因素(如恶性疟疾)和药物毒性反应等因素引起。红细胞内液中含有大量血红蛋白且某些化学组分与血浆或血清浓度不同，溶血会造成血细胞内血红蛋白等物质及细胞内液进入到血清中。在应用ELISA方法检测乙肝表面抗原时，反应孔对血红蛋白有非特异性吸附作用，细胞内液的进入也造成对血清的稀释作用，对检验结果有影响，尤其是在对阴性血清的检验中，即使轻度溶血也会造成假阳性的结果。因此，在实际工作中，护士抽血、检验人员进行血清处理时都要严格注意避免溶血现象的发生，已溶血的标本不能使用。
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3.2 从表2中可以看出，洗涤液的浓度配制一定要按说明书严格配制，浓度过小就有可能阴性标本出现假阳性。实验操作时，日常标本的检测量是成批的，有时多达上100个，这时更要求操作者不能急于求成，最少洗板3～5次，否则有可能出现大量假阳性结果。洗板液泡板时间过短，也会造大量假阳性结果， 因此洗板时，不能急于将洗涤液从板孔中倒掉，而要将洗涤液在孔中停留一段时间(10～20秒)，这样就能洗得更干净，提高结果的准确性。板上的残液没有拍干净，也会影响检测的阴性标本出现假阳性。另外在洗板前注意观察孔内液体是否含有纤维蛋白，如有，一定要挑出后再用洗板机进行洗涤， 否则可能会使洗头堵塞， 并易出现“花板”现象。
影响HBsAg的因素很多，这就要求我们要增强责任感，对实验条件、操作规程、试剂与仪器、实验人员的操作水平等进行严格的质量控制，充分认识和避免。
收稿日期：2008-04-28, http://www.100md.com(马玲娟 张哓莉 府伟灵 黄君富 张 波 薛 强 曹 利)