骨髓取材快速染色方法初探
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【摘要】目的：探讨一种快速染色方法以判断骨髓取材情况。方法：向只加有瑞氏-姬姆萨染液的髓膜上哈一口气，立即水洗、镜检以观察骨髓取材情况。结果：能较为清晰地识别骨髓特异成分。结论：向只加有瑞氏-姬姆萨染液的髓膜上哈一口气进行染色是一种理想的判断骨髓取材情况的快速染色方法。
【关键词】骨髓；快速染色；二氧化碳
文章编号：1009-5519(2008)24-3670-02 中图分类号：R446 文献标识码：A
骨髓细胞形态学检查主要用于观察骨髓涂片中细胞形态、数量等方面的变化，借以了解骨髓造血功能状况。骨髓象检查对多数疾病及其他一些疾病的诊断、鉴别诊断、疗效观察和预后判断具有重要意义[1]。骨髓的取材成功与否直接影响骨髓象的分析结果，目前细胞学工作者对于骨髓片取材的情况通常是直接肉眼观察髓膜上有无骨髓小粒或常规瑞氏-姬姆萨复合染液+磷酸盐缓冲液染色后镜检观察髓膜上有无骨髓特异成分(如骨髓小粒、巨核细胞、白血病细胞、幼红幼粒细胞等)来加以判断，若有上述成分则认为穿刺成功而进行后续步骤的操作，否则就判为不合格而需重新取材送检。我们在工作中对判断骨髓取材情况的快速染色方法进行了初步探索，现将结果报道如下。
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1 材料与方法
1.1 试剂配制
1.1.1 瑞氏一姬姆萨复合染液：瑞氏粉1 g， 姬姆萨粉0.5 g，甘油15 ml，甲醇500 ml，混匀。
1.1.2 磷酸盐缓冲液(pH 6.4~6.8)磷酸二氢钾0.3 g， 磷酸氢二钠0.2 g，再加蒸馏水至1 000 ml。
1.2 仪器：普通光学显微镜。
1.3 方法：对我院2006~2007年100例骨髓穿刺患者由临床医生按常规操作行髂骨穿刺取骨髓液0.2~0.5 ml，由细胞学室人员用清洁玻片按推片法制作髓片(要求片膜厚薄适宜、头体尾分明、分布均匀、边缘整齐、两侧留有空隙)，各备片3张，分别编号分为3组：A组：直接肉眼观察髓膜上有无骨髓小粒(特别是片尾和两侧)；B组：按如下步骤进行瑞氏-姬姆萨复合染液+磷酸盐缓冲液染色：(1)加瑞氏-姬姆萨复合染液2~5滴与片膜上，固定0.5~1分钟；(2)滴加等量或稍多的磷酸盐缓冲液，与瑞氏-姬姆萨复合染液混匀，染色5~10分钟；(3)用流水从片膜一侧缓缓冲掉染液(勿先倒去染液)，待干，镜检观察有无骨髓特异成分；C组：向只加有瑞氏-姬姆萨复合染液的髓膜上哈一口气，立即流水冲洗、吸水纸吸干，镜检以观察髓膜上有无骨髓特异成分(如骨髓小粒、巨核细胞、白血病细胞、幼红幼粒细胞等)。
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2 结果(见表1)
3 讨论
骨髓的取材好坏直接关系到骨髓象的分析结果，若取材不理想就得不出真正反应病人实际病情的诊断结论，造成误诊漏治，特别是恶性病例(如白血病、淋巴瘤等)，将给病人带来极大的身心伤害，还可能引起医疗事故及纠纷。对于骨髓的取材情况判断，形态学工作者常常是通过直接肉眼观察髓膜上有无骨髓小粒或常规瑞氏-姬姆萨复合染液+磷酸盐缓冲液染色后镜检观察有无骨髓特异成分(如骨髓小粒、巨核细胞、白血病细胞、幼红幼粒细胞等)加以判断，若无上述成分则认为穿刺失败。实验中A组通过直接肉眼观察片膜有无骨髓小粒来判断骨髓取材情况的准确率仅为76%，可能是对于部分病例，如部分白血病、淋巴瘤及化疗后的骨髓病人，由于其骨髓小粒不明显，加上操作者经验不足漏检所致；B组采用常规瑞氏-姬姆萨复合染液+磷酸盐缓冲液染色后镜检观察有无骨髓特异成分(如骨髓小粒、巨核细胞、白血病细胞、幼红幼粒细胞等)来判断骨髓取材情况的准确率为100%，这方法准确率高，为通用方法。但所需染色时间较长，并且其影响因素较多，如染液性能、浓度、片膜厚度、温度、染液的量、染液和缓冲液比例及操作者的熟练程度等。常规染色至少也需要5~20分钟[2]。在瑞氏-姬姆萨复合染色法中加磷酸盐缓冲液早在1920年已提出，并沿用至今。近年来国内好一些实验室采用蒸馏水代替磷酸盐缓冲液，均可染出合格的涂片[3]。C组是在加有瑞氏-姬姆萨复合染液的髓膜上不加缓冲液、蒸馏水，而是向其哈一口气代替，并立即流水冲洗、吸水纸吸干，镜检观察所染髓片也能较清晰地识别骨髓特异成分(如骨髓小粒、巨核细胞、白血病细胞、幼红幼粒细胞等)，这方法的准确率为100%，所需染色时间仅需数秒钟即可。此方法操作简单，只需少量瑞氏-姬姆萨复合染液，不加磷酸盐缓冲液或蒸馏水，节约了成本。并且大大缩短了穿刺医生等待报告“穿刺成功与否”的时间，提高了工作效率，极大地缓解了病人的焦虑情绪并减轻了病人的痛苦。瑞氏-姬姆萨染液是由酸性染料伊红和碱性染料美兰组成的复合染料，染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞和细胞的各种成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。例如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色；细胞核蛋白和淋巴细胞浆为酸性，与碱性染料美兰或天青结合，染浅蓝色或紫色；中性颗粒呈等电状态，与伊红和美兰均可结合染紫红色。细胞的各种成分均为蛋白质构成，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美兰或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感。在加有瑞氏-姬姆萨复合染液的髓膜上以哈一口气来代替加缓冲液、蒸馏水，可能是口中的二氧化碳和空气中的水蒸气结合生成碳酸，使染液的pH值更接近于细胞蛋白质的等电点，保持了细胞着色的酸碱度而使各种细胞和细胞的各种成分与染料得到了很好的结合。向髓膜上哈一口气可能更有利于染液渗透到细胞内而加速染色，从而缩短了染色时间。
参考文献：
[1] 叶应妩，王毓三，申子瑜. 全国临床检验操作规程[M].第三版.江苏：东南大学出版社，2006.145.
[2] 杨锡明，肖太武，李光耀，等.快速瑞氏-姬姆萨复合染色法[J].上海医学检验杂志，1996，11(3)：192.
[3] 梁维岗，李善萍，樊菊娥.血细胞姬姆萨瑞氏染色法中使用缓冲液的探讨[J].临床检验杂志，1996，14(6)：318.
收稿日期：2008-07-08 修回日期：2008-08-15, 百拇医药(丁 飞 赵 奇 李 季)