胡湘麟，卿鑫，曾凡才△

    (西南医科大学：1.临床医学院；2.生物化学与分子生物学实验室，四川泸州646000)

    人LDH-B 基因克隆及其真核表达载体的构建*

    胡湘麟1，卿鑫2，曾凡才2△

    (西南医科大学：1.临床医学院；2.生物化学与分子生物学实验室，四川泸州646000)

    目的克隆人乳酸脱氢酶B(LDH-B)基因并构建其真核表达载体。方法提取人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的总RNA，逆转录生成cDNA，以cDNA为模板，采用PCR扩增获得LDH-B基因编码区序列片段，限制性核酸内切酶Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切LDH-B基因片段及pUC19质粒，连接反应构建pUC19-LDH-B克隆载体，并将其转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，蓝白筛选挑取白色菌落，酶切验证后测序鉴定。将序列正确的LDH-B基因亚克隆到pcDNA3.1(-)载体上，构建LDH-B真核表达载体pcDNA3.1(-)-LDH-B。结果PCR扩增后可见约1.0 kb的特异性条带，与预期的LDH-B片段长度相符合；Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切pUC19-LDH-B后可见约2.6 kb和1.0 kb的条带，分别与pUC19和LDH-B的片段长度相符合，LDH-B测序结果与DNA序列数据库(Genebank)中的参考序列相一致；Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切pcDNA3.1(-)-LDH-B后可见约5.5 kb和1.0 kb的条带，分别与pcDNA3.1(-)和LDH-B的片段长度相符合。结论成功克隆了人LDH-B基因，并构建了其真核表达载体，为进一步探究LDH-B的生物学功能奠定了基础。

    L-乳酸脱氢酶；基因；克隆，分子；遗传载体；真核细胞

    乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解最后一步反应中负责催化丙酮酸与乳酸相互转变的一组同工酶，是由LDH-A和LDH-B 2种亚基以不同的比例组装而成，主要有LDH1(B4)、LDH2(A1B3)、LDH3(A2B2)、LDH4(A3B1)、LDH5(A4)5种形式。通常情况下，LDH1和LDH2存在于心肌并催化乳酸生成丙酮酸，而LDH4和LDH5存在于骨骼肌并催化丙酮酸生成乳酸，即四聚体中LDH-A的比例越高，则该同工酶催化丙酮酸发生乳酸反应的能力也就越强。研究发现，LDH4和LDH5还普遍高表达于恶性肿瘤组织中，通过上调LDH-A/LDH-B比例，促进肿瘤乳酸产生，造成组织乳酸堆积，密切影响着肿瘤的增殖、侵袭和转移。抑制LDH-A以减少乳酸生成被认为是抗肿瘤治疗的理想靶点之一[1-2]。

    LDH-B作为构成LDH的另一种亚基形式 ......