陈恒君，田超群，杨钰兴，袁睿(重庆市渝北区人民医院：.皮肤科；.泌尿外科400)

    恶性黑素瘤是由皮肤、黏膜、眼等色素沉着部位的黑素细胞产生的一种高度恶性肿瘤，其特点为生长隐匿、转移早且迅速，患者预后差及病死率高，致死率达79.0%[1?3]。目前，已确定小眼畸形相关转录因子(MITF)在黑素细胞和黑素瘤细胞核中高表达[4?5]，是核蛋白最重要的转录因子，具有较强的诊断灵敏度和特异性[6?7]，但相关机制研究较少。本研究采用RNA干扰技术，研究了MITF对恶性黑素瘤的生长及黑素生成能力的影响，试图为恶性黑素瘤的治疗提供新的思路和策略，现报道如下。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 pLKO.1?短发夹RNA(shRNA)载体。

    1.1.2 细胞系 B16F10黑素瘤细胞系购自KeyGen公司。细胞生长基质(培养液 1)为 RPMI?1640、10% 胎牛血清。细胞培养箱条件为37℃及5%二氧化碳。

    1.1.3 主要试剂 RPMI?1640、10%胎牛血清均购自HyClone公司；mRNA提取试剂盒Trizol Reagent、逆转录试剂盒 PrimeScript?RT reagent Kit、扩增试剂盒SYBR Green RT?PCR Kit均购自 TaKaRa公司；蛋白抽提试剂盒、蛋白质印迹跑胶试剂盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、蛋白质印迹显影ECL化学发光试剂盒、Tri?ton?X100、MTT细胞活性检测试剂盒均购自Beyotime公司；蛋白定量试剂盒采用Pierce?BCA Protein Assay Kit，购自Thermo Scientific公司；免疫组织化学试剂盒购自博士德公司；MITF、β?actin蛋白抗体均购自Santa公司；DNA Marker、RNA Marker、LipofectamineTM2000均购自Invitrogen公司；嘌呤霉素购自Sigma公司；MITF?shRNA质粒由KeyGen公司构建，并根据片段不同分别标注为 B16F10?NC(空白质粒对照)、B16F10?1、B16F10?2、B16F10?3，另建立未用任何质粒转染的阴性对照(B16F10组)。

    1.2 方法

    1.2.1 构建稳定干扰MITF表达的B16F10细胞系 将对数生长期B16F10细胞系传代并过夜(约24 h)培养，按标准流程，使用LipofectamineTM2000将扩增的shR?NA质粒中MITF沉默片段转染该细胞系。48 h后 ......