Shh基因在NIPBL+/-胎鼠肢芽内的表达*
孕鼠,逆转录,1材料与方法,2结果,3讨论
王 莉,潘金勇,嵇继宇,张惠荣(石河子大学医学院第一附属医院儿科,新疆石河子832000)Cornelia de Lange综合征(CdLS)是一种罕见的先天性疾病,患病率为1/100 000~1/10 000[1]。临床表现主要为严重的生长发育迟缓、智力障碍、畸形等[2]。CdLS的患者约60%是NIPBL基因发生了病理性变化[3]。有研究表明,NIPBL基因水平的高低与CdLS的严重程度密切相关[4]。Shh基因是由ZRS增强子调控参与肢芽的发育[5],Shh基因在由ZRS增强子调控的胚胎极化活性区(ZPA)进行肢芽的表达[6]。然而,在小鼠胚胎发育阶段的肢芽中,NIPBL基因对位于ZPA区域的Shh基因具有调控作用,会影响Shh基因的表达。但2个基因之间
的具体交互作用及规律鲜见文献报道。本研究采用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠杂交,建造NIPBL+/-小鼠模型,探讨NIPBL对Shh基因表达的影响,为CdLS的诊断和干预提供新的策略。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠的背景品系小鼠是C57BL/6J,SPF级,购于浙江大学,全部小鼠饲养于石河子大学药学院实验动物中心。实验过程遵照石河子大学《动物实验伦理委员会管理条例》。挑选NIPBL+/-小鼠雄性体重35 g左右,雌性体重30 g左右,晚上20:00将雌雄小鼠按2∶1合笼,次日早晨8:00检查雌鼠的阴栓,阴栓阳性者将次日12:00作为其胚胎E0.5天。
1.1.2 仪器与试剂 逆转录试剂盒Prime Script RT reagent Kit购于Thermo公司;总RNA提取剂Trizol Reagent购于Life公司;逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购于Thermo公司;荧光定量试剂盒SYBR Green PCR Kit购于Thermo公司;普通聚合酶链反应(PCR)仪器购于TaKaRa公司;荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)仪器购于Life公司。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立和实验分组 采用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠建造NIPBL+/-小鼠模型,NIPBL+/-小鼠与NIPBL+/-小鼠按照雌、雄2∶1合笼进行杂交,分别在孕鼠的E10、E11、E12天取出孕鼠放在超净台内,以颈部脱臼法处死孕鼠,在严格无菌操作条件下,分别在孕鼠的E10、E11、E12天用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)逆转录试剂盒鉴定得到6只NIPBL+/-胎鼠的肢芽作为实验组 ......
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