陈年杰，洪裕程，沈 悦，王进涛，钟良军，△

    (1.杭州师范大学医学部口腔医学院，浙江 杭州 311121；2.杭州师范大学附属医院口腔医学中心，浙江 杭州 310015)

    缺氧是一种常见的致伤因素，对机体炎症性疾病的发生、发展具有重要的调节作用。机体对炎症组织中缺氧的适应性反应是通过激活和积累缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)来进行。HIF-1α是一种异源二分转录因子，是在缺氧条件下可发挥生物活性的唯一一种特异性转录因子，在调控基因表达以维持氧稳态方面起着重要作用[1]。常氧条件下，HIF-1α亚基通过细胞内氧依赖性泛素蛋白酶快速降解。然而，在低氧条件下，HIF-1α亚基的降解被抑制，并与HIF-1β形成异源二聚体，转移到细胞核中调节多种基因的转录[2]。HIF-1α被认为是许多疾病的影响因素，可以调节促炎基因的表达，HIF-1α蛋白在牙周炎患者牙龈组织中的表达已被证实[3]。HIF-1α与心血管疾病也有密切关系。有研究发现[4],HIF-1α通过使血管增生参与动脉粥样硬化的发生、发展，后继研究发现斑块内新生血管生成与斑块内出血、破裂和炎性浸润密切相关。

    簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9是细菌和古细菌形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，在短短数年内便风靡全球,成为现有基因编辑和基因修饰里效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，也是当今最主流的基因编辑系统。人胚胎肾细胞293(HEK-293细胞)具有转染高效性、易于培养等特点，是一种常用的表达研究外源基因的细胞株。本实验拟利用CRISPR/Cas9技术构建质粒并敲除HEK-293细胞的HIF-1α基因，为进一步探索和证实HIF-1α功能及后续研究打下基础。现报道如下。

    1 材料与方法

    1.1材料 HEK-293细胞株(CRL-1573)购于美国模式培养物集存库；Stbl3感受态细胞、LentiCRISPR V2质粒(ZK611)购于北京庄盟生物基因科技有限公司；转染试剂Lipofectamine 3000、Opti-MEM培养基购于美国赛默飞世尔科技公司；DMEM高塘培养液购于美国Gibco公司；胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、细胞DNA提取试剂盒购于北京天根生化科技有限公司;BsmBI限制性核酸内切酶、T4 DNA Ligase、T7E1核酸内切酶购于美国New England Biolabs公司；聚合酶链式反应(PCR) mix、嘌呤霉素、Western blotting套装、qPCR套装购于上海碧云天公司；HIF-1α抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体购于英国Abcam公司；引物合成委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行 ......