乳腺癌组织基因组DNA提取方法的优化
〔摘要〕目的DNA的提取是分子生物学研究的基础技术,提取DNA的纯度及及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件。近年来一些新的或改进的DNA提取纯化方法不断出现,本实验以乳腺癌及癌旁组织做为实验材料,将传统的DNA提取法进行了优化,用改进的方法提取的DNA含量高、纯度高,可以作为PCR反应的模板及后续分析的高纯度样品。
〔关键词〕基因组DNA;提取方法;优化;乳腺癌
〔中图分类号〕R737.9〔文献标识码〕A〔文章编号〕1009-6019-(2010)04-18-02
随着分子生物学技术的不断发展,将组织的总DNA提取出来进行DNA杂交、PCR扩增、基因组克隆的实验需求越来越多。目前提取组织基因组DNA的方法很多,提取到适用于扩增的DNA样品是分子生物学技术成功运用的前提。DNA的提取往往因方法不一结果有较大差异,我们最初参照传统酚氯仿法〔1〕提取乳腺癌组织基因组DNA,结果不甚理想,为此在预备实验的基础上,将基因组DNA提取的常用方法进行了大胆的改进,最终获得了高浓度,高纯度的基因组DNA,此改良法适于小批量DNA提取的需要,也适合通过PCR扩增。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1药品试剂
TE:用Tris-HCl(pH7.8)、EDTA(pH8.0)和乙二胺四乙酸配制;蛋白酶K(2mg/dL);酚-氯仿(1:1);氯仿-异戊醇(24:1);无水乙醇;乙酸钠(2mg/dl)、70%乙醇;裂解液缓冲液:用10mmol/lLTris-HCl(pH8.0)、0.1mol/LEDTA(pH8.0)、0.5g/mLSDS及20μg/mL无DNase的胰RNase配制;RNaseA;溴酚蓝;琼脂糖凝胶(0.8%)。
1.2材料
所有样品均由青海大学附属医院病理科收集,经组织切片证实为乳腺癌的组织及癌旁组织,标本注明采集日期,住院号等相关信息,后置于-70℃冰箱储藏备用。
1.3操作程序(1)DNA提取取癌样(A)0.15g及癌旁样(B)0.15g,各加入裂解缓冲液液〔6〕1.5ml,后于匀浆器充分匀浆;将匀浆液倒入1.5mL离心管中,分别加入20μl蛋白酶K,后置于65℃水浴30min;12000r/min离心5min,取上清与另一离心管中;加入等量酚-氯仿,12000r/min离心5min;取上清与另一离心管中,加入等体积氯仿-异戊醇,12000r/min离心5min;取上清与另一离心管中,加入1/2体积乙酸钠(2mg/dL)、等体积无水乙醇;12000r/min离心5min,弃上清;将离心管倒置于吸水纸上干燥;1mL70%乙醇溶解沉淀,12000r/min离心5min;弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,室温干燥;加入20μLTE重新溶解沉淀,后置于-20℃保存备用。(2)电泳条件确定从每支离心管中分别取1μL、2μL、3μL样品各加入2μL溴酚蓝,进行最适点样量和浓度测试,进行电泳,电泳结果显示原液5μLā加入TE2.5μL后,取3μL点样效果最佳。
, http://www.100md.com
2结果
提取的DNA用分光光度计测量A260和A280吸光度值,DNA产量公式按〔dsDNA〕=50×A260×稀释倍数100倍计算。其结果为改进的提取方法所获得的DNA平均产量浓度是(200±62)mg/L,A260/280为1.75±0.10。传统酚氯仿法提取的DNA平均产量浓度为(186±64)mg/L,A260/280为1.70±0.09。将从乳腺癌及癌旁组织中提取的DNA经0.8%琼脂糖凝胶进行电泳,Mark为HindⅢ,得到如图2所示的结果,提取出了较大片段的DNA,均为完整的基因组DNA,而且RNA、蛋白质、糖类等污染也很少,表明所提DNA比较纯净。再用所提DNA进行PCR反应时,得到的扩增片段清楚整齐。
3讨论
实验选用的较高浓度的裂解液和蛋白酶K,既分别按1.5μL和20μL的量加入,目的在于将乳腺癌及癌旁组织充分匀浆,同时调整了电泳的浓度和点样量,此方法提取的基因组DNA完全符合分子生物学实验的要求。
, http://www.100md.com
快速、经济的从各种样本中提取高纯度、高产量的DNA已经成为PCR技术研究发展的主要问题。针对各种实验样品的特性,在进行DNA提取时可选择不同的方法〔2〕。一般情况下,要获得高纯度的DNA,即要保证其一级结构的完整性,又要排除其他生物大分子和RNA分子的污染。此实验在传统的酚-氯仿提取方法的基础上进行了改进,乳腺癌及癌旁组织和其他组织相比,其含有的脂肪组织、结缔组织较多,实验结果较易受这些因素的影响,因此对组织充分匀浆也是该实验成功的关键之一,实验选用的了较高浓度的裂解液和蛋白酶K,将乳腺癌及癌旁组织充分匀浆。本实验提取DNA的方法是在数十次的实践中不断摸索、总结后对传统的酚-氯仿法〔3〕进行了优化,通过琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,得到的DNA具有含量多、纯度高等特点,而且RNA、蛋白质、等物质污染少。通过此法提取乳腺癌及癌旁组织基因组DNA,简单易行,而且为乳腺癌发病的分子机制的研究及后续工作提供了有力保障;这种经过改良的组织DNA提取方法也可用于其他组织DNA的提取,可为后续的分子生物学实验打下良好的基础,具有较广泛的应用前景。
4参考文献
1萨姆布鲁克J.费里奇EF.金冬雁,黎孟枫译.分子克隆实验指南〔M〕.第2版.北京:科学出版社,1992:463-469.
2赵铁军,韩瑞,春华.三种全血基因组DNA提取方法的比较〔J〕.张家口医学院学报,2003,20(4):46-47.
3王龙武,石柯,彭爱红.一种快速微量外周血基因组DNA提取方法〔J〕.中国现代医学杂志,2004,14(2):70-72.
〔收稿日期:2010-03-29〕, http://www.100md.com(顾存 林李耀东)
〔关键词〕基因组DNA;提取方法;优化;乳腺癌
〔中图分类号〕R737.9〔文献标识码〕A〔文章编号〕1009-6019-(2010)04-18-02
随着分子生物学技术的不断发展,将组织的总DNA提取出来进行DNA杂交、PCR扩增、基因组克隆的实验需求越来越多。目前提取组织基因组DNA的方法很多,提取到适用于扩增的DNA样品是分子生物学技术成功运用的前提。DNA的提取往往因方法不一结果有较大差异,我们最初参照传统酚氯仿法〔1〕提取乳腺癌组织基因组DNA,结果不甚理想,为此在预备实验的基础上,将基因组DNA提取的常用方法进行了大胆的改进,最终获得了高浓度,高纯度的基因组DNA,此改良法适于小批量DNA提取的需要,也适合通过PCR扩增。
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1材料与方法
1.1药品试剂
TE:用Tris-HCl(pH7.8)、EDTA(pH8.0)和乙二胺四乙酸配制;蛋白酶K(2mg/dL);酚-氯仿(1:1);氯仿-异戊醇(24:1);无水乙醇;乙酸钠(2mg/dl)、70%乙醇;裂解液缓冲液:用10mmol/lLTris-HCl(pH8.0)、0.1mol/LEDTA(pH8.0)、0.5g/mLSDS及20μg/mL无DNase的胰RNase配制;RNaseA;溴酚蓝;琼脂糖凝胶(0.8%)。
1.2材料
所有样品均由青海大学附属医院病理科收集,经组织切片证实为乳腺癌的组织及癌旁组织,标本注明采集日期,住院号等相关信息,后置于-70℃冰箱储藏备用。
1.3操作程序(1)DNA提取取癌样(A)0.15g及癌旁样(B)0.15g,各加入裂解缓冲液液〔6〕1.5ml,后于匀浆器充分匀浆;将匀浆液倒入1.5mL离心管中,分别加入20μl蛋白酶K,后置于65℃水浴30min;12000r/min离心5min,取上清与另一离心管中;加入等量酚-氯仿,12000r/min离心5min;取上清与另一离心管中,加入等体积氯仿-异戊醇,12000r/min离心5min;取上清与另一离心管中,加入1/2体积乙酸钠(2mg/dL)、等体积无水乙醇;12000r/min离心5min,弃上清;将离心管倒置于吸水纸上干燥;1mL70%乙醇溶解沉淀,12000r/min离心5min;弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,室温干燥;加入20μLTE重新溶解沉淀,后置于-20℃保存备用。(2)电泳条件确定从每支离心管中分别取1μL、2μL、3μL样品各加入2μL溴酚蓝,进行最适点样量和浓度测试,进行电泳,电泳结果显示原液5μLā加入TE2.5μL后,取3μL点样效果最佳。
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2结果
提取的DNA用分光光度计测量A260和A280吸光度值,DNA产量公式按〔dsDNA〕=50×A260×稀释倍数100倍计算。其结果为改进的提取方法所获得的DNA平均产量浓度是(200±62)mg/L,A260/280为1.75±0.10。传统酚氯仿法提取的DNA平均产量浓度为(186±64)mg/L,A260/280为1.70±0.09。将从乳腺癌及癌旁组织中提取的DNA经0.8%琼脂糖凝胶进行电泳,Mark为HindⅢ,得到如图2所示的结果,提取出了较大片段的DNA,均为完整的基因组DNA,而且RNA、蛋白质、糖类等污染也很少,表明所提DNA比较纯净。再用所提DNA进行PCR反应时,得到的扩增片段清楚整齐。
3讨论
实验选用的较高浓度的裂解液和蛋白酶K,既分别按1.5μL和20μL的量加入,目的在于将乳腺癌及癌旁组织充分匀浆,同时调整了电泳的浓度和点样量,此方法提取的基因组DNA完全符合分子生物学实验的要求。
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快速、经济的从各种样本中提取高纯度、高产量的DNA已经成为PCR技术研究发展的主要问题。针对各种实验样品的特性,在进行DNA提取时可选择不同的方法〔2〕。一般情况下,要获得高纯度的DNA,即要保证其一级结构的完整性,又要排除其他生物大分子和RNA分子的污染。此实验在传统的酚-氯仿提取方法的基础上进行了改进,乳腺癌及癌旁组织和其他组织相比,其含有的脂肪组织、结缔组织较多,实验结果较易受这些因素的影响,因此对组织充分匀浆也是该实验成功的关键之一,实验选用的了较高浓度的裂解液和蛋白酶K,将乳腺癌及癌旁组织充分匀浆。本实验提取DNA的方法是在数十次的实践中不断摸索、总结后对传统的酚-氯仿法〔3〕进行了优化,通过琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,得到的DNA具有含量多、纯度高等特点,而且RNA、蛋白质、等物质污染少。通过此法提取乳腺癌及癌旁组织基因组DNA,简单易行,而且为乳腺癌发病的分子机制的研究及后续工作提供了有力保障;这种经过改良的组织DNA提取方法也可用于其他组织DNA的提取,可为后续的分子生物学实验打下良好的基础,具有较广泛的应用前景。
4参考文献
1萨姆布鲁克J.费里奇EF.金冬雁,黎孟枫译.分子克隆实验指南〔M〕.第2版.北京:科学出版社,1992:463-469.
2赵铁军,韩瑞,春华.三种全血基因组DNA提取方法的比较〔J〕.张家口医学院学报,2003,20(4):46-47.
3王龙武,石柯,彭爱红.一种快速微量外周血基因组DNA提取方法〔J〕.中国现代医学杂志,2004,14(2):70-72.
〔收稿日期:2010-03-29〕, http://www.100md.com(顾存 林李耀东)