娄海伟，林俊芳，赵仁勇，叶志伟，田双起，王新伟，郭丽琼*，赵 玉*

    (1 河南工业大学粮油食品学院 郑州 450001 2 华南农业大学食品学院 广州 510642)

    蛹虫草 (Cordyceps militaris) 又名北冬虫夏草，是虫草属的模式种，已实现人工规模化栽培。蛹虫草作为一种新食品原料，其菌丝体和子实体富含多种生物活性成分，如虫草素[1]、免疫调节蛋白[2]、虫草多糖[3]、新型黄色素[4-5]、喷司他丁[6]等，具有抗癌[7]、免疫调节[2-3]、抗炎[8]、抗氧化[9]等功效。基于此，蛹虫草的市场需求量逐年增多，在东南亚国家被广泛食用，目前在西方国家亦得到广泛推广。

    虽然蛹虫草含有多种生物活性成分，但是其含量较低，不能满足市场需求。提高蛹虫草生物活性成分的含量是亟待解决的关键问题。采用基因工程方法(如异源表达、关键基因超表达等)可从根本上解决这一问题，然而需要鉴定(活性物质生物合成途径中)关键基因的功能。鉴定基因功能的方法有基因敲除[10]、基因超表达[11]、RNA 干扰[12]等技术，然而，使用上述技术需要选择标记基因来筛选目标转化子，目前在蛹虫草基因功能鉴定中被广泛使用的筛选标记基因为膦丝菌素(Phosphinothricin)乙酰转移酶基因(即Bar基因)[13-14]。

    构建载体较常用的方法为T4 DNA 连接酶法[15]，通过对载体、插入片段进行限制性内切酶酶切，然后在T4 DNA 连接酶的作用下实现载体和插入片段的连接；而同源重组法构建载体是一种较新的方法[16]，通过限制性内切酶酶切或者PCR方法制备线性载体，然后在重组酶的作用下实现线性载体和插入片段的重组。上述两种构建载体的方法，哪一种更快速、更高效，目前未见对比上述两种方法的相关报道。本研究首先采用双接头PCR(Double-joint PCR，DJ-PCR)方法构建Bar基因表达盒；其次，以双元载体pAg1-H3 作为出发载体，通过构建标记基因载体(pAg-Bar)，比较两种载体构建方法 (T4 DNA 连接酶法和同源重组法)的效果，旨在获得一种更快速、高效的载体构建方法。最后通过农杆菌介导转化法(Agrobac terium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)来验证载体pAg-Bar 的有效性及Bar基因在蛹虫草中的功能。为促进蛹虫草基因功能鉴定，加快蛹虫草活性物质代谢通路研究，以及通过生物技术方法提高蛹虫草活性物质的产量奠定基础。

    1 材料和方法

    1.1 菌株与试剂 ......