韩秀娥，秦兰霞，邵 红，任浩威

    (东北农业大学食品学院 哈尔滨 150030)

    谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase.EC2.3.2.13，TGase)，又称转谷氨酰胺酶，广泛存在于哺乳动物、鱼类、植物、细菌、真菌和绿藻等生物中[1-9]，具有催化蛋白质分子内和分子间交联，蛋白质和氨基酸间连接，以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解功能。通过TGase 催化反应能提高蛋白质的弹性、发泡性、溶解性、乳化性、持水性和热稳定性，从而改善蛋白质功能特性，在食品工业中具有很好的应用前景[9-19]。

    国内使用的产谷氨酰胺转胺酶菌株的产酶量低，酶活低。为解决目前谷氨酰胺转胺酶的生产成本过高，产量不能满足市场需求等问题，需要获得一株高产谷氨酰胺转胺酶的菌株。随着基因工程的飞速发展，利用基因工程手段生产酶制剂和生物制药得到广泛应用[20-25]。采用基因工程的方法获得具有自主知识产权的产谷氨酰胺转胺酶菌株，是解决目前问题的一个重要手段。

    毕赤酵母是一种单细胞的真核生物，在小量培养基和大规模生物反应器中都能快速生长。同其它表达系统一样，在实际应用和生产中，毕赤酵母高效生产外源蛋白受许多因素的影响[26-30]。本课题的主要目的是将前期构建的重组表达质粒pPIC9K-TGZ，经Sac I 线性化处理，电转入巴斯德毕赤酵母GS115，优选出最佳表达条件，为下游蛋白提纯及酶的生物功能特性研究奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 菌种与试剂

    巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)GS115、质粒酵母表达载体pPIC9K-TGZ，东北农业大学乳品重点实验室。各种限制性内切酶，TaKaRa 公司；酵母基因组DNA 提取试剂盒，TIANGEN。

    异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，上海华舜生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，OXOID 公司；丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、Tris-Base、四甲基已二铵(TEMED)、过硫酸铵(APS)、甘氨酸、酵母氮源培养基(YNB)，GIBCO 公司；蛋白分子量标准，Fermentas；TritonX-100、EB (溴化乙锭)，美国Sigma 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 毕赤酵母的转化及筛选 毕赤酵母转化采用电转化法。重组质粒pPIC9K-TGZ 经Sac I 线性化处理电转化至感受态细胞毕赤酵母GS115。以空质粒pPIC9K 作为阴性对照 ......