刘琛，丛琳，刘文俊，张和平*

    (1 内蒙古农业大学 呼和浩特0100182 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 呼和浩特010018 3 乳酸菌与发酵乳制品省部共建协同创新中心 呼和浩特 010018)

    塔吉克斯坦坐落于中亚，地处北温带(北纬36°40' 至41°05')，其境内多山地高原，为典型的内陆高山国家[1]。其国内气候温和，雨水量充足，水草肥美，良好的气候环境造就了天然牧场，农业和畜牧业的发展占据了主导地位，而居民生活多为半定居、半游牧，沿袭着古老而传统的生产、生活方式。良好的气候环境和原生态生活方式使得酸牛乳、奶疙瘩、奶皮子等传统发酵乳制品在当地人一日三餐中占重要比例[2-3]。事实上，每个国家都有自己独特的饮食习俗以及特有的食品种类和制作方法[4-5]。不同地区的发酵乳制品都具有悠久的历史，像是一个个“天然的菌种宝库”，成为研究不同地域饮食中微生物多样性的良好材料。

    乳酸菌分类鉴定的方法分为传统纯培养生理生化分类鉴定法和非培养分子生物学鉴定法。传统纯培养方法通过生理及表型鉴定，所得研究结果准确性较低，误差较难避免，而且费时、费力。而非传统的分子生物学方法可以提取样品中微生物宏基因组，利用菌株基因组序列之间的特异性对菌群结构、丰度、多样性进行研究。由于其可高效、快速、全面再现生境中微生物菌群等优势，因此基于宏基因测序的方法在乳酸菌分类鉴定中广泛应用[6-7]。通过纯培养的方法分离纯化得到样品中微生物并作鉴定，然后利用非培养的方法分析其多样性，两者相互补充，是分析微生物群落结构和多样性的科学方法。

    塔吉克斯坦地理条件和气候条件独特，乳制品资源丰富。当地的游牧民族长期饮用的发酵牛乳是以新鲜牛乳为原料自然发酵而成的。其发酵过程大都不需添加商品发酵剂，而是用前1 d 的酸乳作为“引子”[8]。由于保持了相对原始的发酵过程，样品中乳酸菌的生物学特性和菌种的多样性得到很好地留存，这些丰富的乳酸菌资源有待于开发和利用。

    本研究采用实验室纯培养方法结合16S rRNA 基因序列分析，对塔吉克斯坦地区自然发酵牛乳中的乳酸菌进行分离纯化及鉴定，为优良菌株的筛选提供资源。应用PacBio SMRT 测序技术揭示自然发酵牛乳中的细菌群落组成，研究该地区自然发酵牛乳中乳酸菌群落结构和多样性。

    1 材料与方法

    1.1 样品的采集

    7 份自然发酵牛乳样品均采自塔吉克斯坦地区牧民家庭，编号为TJ1～TJ7。每个样品采集一式两份，均使用50 mL 无酶无菌管，每个样品采集20 mL ......