田艾迪，刘瑛，陈叶平，史海粟，岳喜庆，武俊瑞，洛雪

    (沈阳农业大学食品学院 沈阳 110866)

    CRISPR/Cas 系统是由成簇的，具有规律间隔的短回文重复序列以及多种CRISPR 相关基因构成的一种细菌的免疫系统。约40%细菌和90%古细菌中都存在CRISPR/Cas 系统[1]。CRISPR/Cas 系统包含重复间隔单元和多种Cas 基因，细胞通过识别Cas 基因编码的蛋白进行免疫反应，对进入细胞的外源DNA 进行切割来保护自身[2]。

    CRISPR/Cas 系统根据Cas 蛋白的结构和功能分为三大类型，包含10 个亚型，6 个Ⅰ型，2 个Ⅱ型和2 个Ⅲ型。其中，I 型和Ⅲ型CRISPR/Cas 系统需要多种CRISPR 相关蛋白(Cas 蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ型系统只需要一种Cas 蛋白即可，因此Ⅱ型CRISPR 系统应用最为广泛[3-4]。

    2013 年2 月，洛杉矶学者们首次发现CRISPR/Cas 系统[5]。此后，因CRISPR/Cas 系统具有操作简便，适用范围广，时间短，单个基因的编辑效率高等优势，近年在不同物种中得以发展应用[6]。目前研究人员己成功利用CRISPR/Cas9 系统对斑马鱼[7-8]、大鼠[9]、山羊[10]、大豆[11]、水稻[12]、烟草[13]、芽孢杆菌[14]、酵母菌[3]、大肠杆菌[15]、乳酸菌[16]、拟南芥[17]等物种进行基因敲除。研究人员在CRISPR/Cas 系统的基础上研发了CRISPR Interference 系统，发现该系统能够仅在mRNA 的层面上进行基因调控，目前细菌CRISPRi 系统已发展较为成熟[18]。本文主要综述CRISPR/Cas9 系统及CRISPRi 系统近年来在芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌等生物的应用。

    1 II 型CRISPR 系统的原理

    Ⅱ型CRISPR 系统包括CRISPR/Cas9 系统、CRISPRi 系统和CRISPRa系统，CRISPR/Cas9 系统的工作原理如图1 所示。

    图1 CRISPR/Cas9 系统原理Fig.1 Principle of the CRISPR/Cas9 system

    CRISPR/Cas9 系统是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracr RNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA 复合物 ......