胰岛素、血管紧张素ＩＩ对人血管内皮细胞ＮＦ-κＢ的激活和血脂康干预的影响(2)
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动脉粥样硬化(AS)是一种炎症性疾病[1]，NF_κ B在其发病机 制中起重要作用[2]，本实验采用胰岛素、Ang II刺激培养的血管内皮细胞，观察 在4h时间点血管内皮细胞NF_κ B的活性及血脂康干预的影响，探讨胰岛素、Ang II致AS的 机制和血脂康抗AS的作用机理[3～5]。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂：人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)冻存管购自中国科学院上海细胞生 物研究所；胎牛血清购自杭州四季青公司；RPMI-1640培养基及胰蛋白酶购自美国Gibco公司 ；血管紧张素II粉剂购自美国Sigma公司；血脂康原粉由北大维信生物科技有限公司惠赠； 短效人胰岛素购自诺和诺德中国制药有限公司；鼠抗人NF_κ Bp65单克隆抗体购自美国Sant a Cruz Biotechnology公司；免疫组化染色ABC试剂盒、DAB显色试剂盒及羊抗鼠FITC二抗均 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 细胞复苏、培养及分组：细胞按常规方法复苏、传代、培养，复苏后2～3代用于实验 。试验分对照组、胰岛素组(100uI/ml)、Ang II组(5×10-8mol/ml)、胰岛素+Ang II 组、胰岛素+血脂康组(150ug/ml)、Ang II+血脂康组、胰岛素+Ang II+血脂康组。血脂康组 中血脂康预先孵育2h。
1.3 血管内皮细胞NF_κ B核易位阳性率[5]：在24孔培养板放入消毒好的盖玻片 ，加入1ml培养的内皮细胞悬液，细胞爬片后，换用含0.5%胎牛血清的培养液培养24小时， 使细胞同步后进行实验。试验试剂和药物按前述分组加入培养孔中与内皮细胞共同孵育4h后 ，行免疫细胞化学染色，方法严格按试剂盒操作说明进行，制片，封片，在显微镜下观察， 于 200倍镜下随机取5个视野，分别计算NF_κ Bp65核易位阳性率(核易位阳性率＝核易位阳性 细胞/视野下细胞总数(核易位阳性细胞的判定：胞核以及靠近核膜的部分胞浆染色呈棕黄色 ......
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