ＬＯＸ＿1在氧化型低密度脂蛋白诱导Ｕ937细胞凋亡中的作用和卡托普利的干预作用(2)
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1.2.2 流式细胞术(FCM)检测凋亡：分组分瓶收集细胞(1×106个)。离心(1000r/min)5 min弃上清液，沉淀中加入2ml磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，离心(1000r/min)5min。弃上清液， 加75%冷乙醇2ml固定，置4℃保存。染色前用PBS离心沉淀去除固定液，加入20μl RnaseA 3 7℃水浴30min，再加800μl碘化吡啶染色液混匀，4℃避光30min。上机检测。
1.2.3 免疫组织化学技术检测caspase蛋白的表达：分组收集细胞，进行免疫组织化学染 色。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性片作为阳性对照。上镜观察阳性细胞数。 结果判定：阳性染色为细胞浆和(或)细胞核内有浅至深棕黄色颗粒，随机选择10个高倍视野 (×400)，记数1000个细胞中所占的阳性细胞数，计算百分比。
免疫印迹法(Western Blot)检测caspase蛋白的表达：取1×106个培养U937细胞洗涤，离 心，用加样缓冲液裂解细胞，100℃水浴10min，离心(10 000r×10min)，收集上清，采用考 马斯亮兰法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。用20ug蛋白/泳道上样 ， 经12%聚丙烯酰胺凝胶SDS_PAGE电泳后，电转膜至硝酸纤维膜。室温封闭3h加1：100 caspas e蛋白的抗体，再加入1：200的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，采用二甲基 联苯胺(DAB)显色试剂盒进行显色约2～5min，待蛋白条带显色清晰时中止反应，拍摄照片， 记录实验结果。
1.3 统计学处理
各种计量数据均以均数±标准差表示，各组数据间显著性检验采用t检验，统计学分析应用S AS(6.12)软件包。P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 各U937细胞凋亡率
各组细胞经流式细胞仪检测DNA周期的结果发现，正常培养的细胞DNA多处于G0/G1期，凋亡 率为(0.098±0.022)%，而ox_LDL处理的细胞DNA在G0/G1期前出现了明显的“亚二倍体峰 ” ......
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