四氧化二氮致伤小鼠血清标志分子的实验研究
[摘要]目的 探讨(N2O4)中毒小鼠血清的蛋白组学变化，可以为进一步研究N2O4中毒致伤机制提供指导。方法实验动物为ICR小鼠，随机分为对照组和模型组，每组8只。将中毒组动物置于军事医学科学院提供的120 L染毒柜中，使用微量注射器定量抽取液态N2O4(100 μl)，注入120 L染毒柜中，并维持染毒柜内N2O4浓度为70g/m3，染毒时间15 min，室内温度保持在15℃。取动物全血并分离出血清，将血清样品在表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(sELDI-TOF-MS)上进行蛋白组学分析。结果 染毒后，动物出现呼吸道、眼睛的刺激症状：流涎、呕吐、紫绀、呼吸困难、躁动、肌肉颤动、肢体抽搐。典型者突然出现四肢痉挛、牙关紧闭、屏息、口吐白沫、大小便失禁。与对照组相比，中毒组小鼠的血清中相对分子质量为3668、3870、4728、4900、5815的一组标志蛋白表达明显升高，相对分子质量为13 619、13 816的标志蛋白表达明显降低(P染毒后的小鼠血清的蛋白组学明显变化，这些差异蛋白可以作为血清标志分子用于进一步N2O4中毒的病理生理学研究。
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[关键词]四氧化二氮；中毒；血清标志分子
四氧化二氮(N2O4)是双组元液体火箭推进剂之一，常温呈气态，极易挥发，在火箭及导弹发射等环节中，容易吸人人体造成急性肺损伤。动物实验研究表明，N2O4中毒以急性肺水肿为主要病理学变化，但其致伤机制尚待进一步研究。因此，笔者在原有实验研究的基础上，制作N2O4中毒致急性肺水肿的动物模型，采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(SELDI-TOF)进行血清蛋白组学研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作
ICR小鼠，体重20-25 g，由北京大学实验动物中心提供，随机分为对照组和模型组，每组8只。染毒模型制作方法：将动物置于军事医学科学院提供的120 L染毒柜中，使用100μl微量注射器定量抽取液态N2O4，注入120 L染毒柜中。染毒柜内备微型电扇，以保证推进剂充分蒸发及均匀分布，维持染毒柜内N2O4质量浓度为70 g/m3染毒时间15 min，室内温度保持在15℃。
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1.2动物中毒表现
动物染毒后，出现呼吸道、眼睛的刺激症状.流涎，呕吐，紫绀、呼吸困难、躁动、肌肉颤动、肢体抽搐。典型者突然出现四肢痉挛，牙关紧闭、屏息、口吐白沫、大小便失禁。
1.3蛋白组学分析
1.3.1蛋白飞行质谱仪 为美国Ciphergen公司生产，型号PBSII-c，实际上是一台表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(sELDI-TOF)。
1.3.2 试剂 尿素、乙腈、三氟乙酸、Tris-HCL9.0、CHAPS、DTF、NaAc、HPLCH2O、Hepes等均购自Sigma公司。
1.3.3 蛋白质芯片 为化学修饰的WCX2，芯片，其表面结合了弱阴型离子羧基，可以和被分析物表面的正电荷基团相互作用(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)而捕获蛋白，可用于检测高等电点的蛋白质和生物标记分子。
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1.3.4 血清样品处理 从-70℃冰箱中取出血清，在4℃，10 000 r/min离心2 min。取3μl血清样品，加6μl处理液，充分混匀，冰浴振荡30 min后取出，加入108μl结合缓冲液，立即混匀。
1.3.5 上样及洗脱 将WCX2芯片装入Bioprocessor中，每孑L加入200μl结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5 min，甩干。每孔分别加入100μl样品混合液，振荡孵育l h，甩去样品，用200μl洗脱缓冲液室温振荡洗涤两次，每次5 min，甩干；再用HPLC H2O洗涤一次，立即甩干。拆开Bioprocessor，取出芯片，晾干后，每点点加两次0.5μl SPA，晾干后即可上机测量。
1.4数据采集
采用蛋白飞行质谱仪(PBSII-C型)对结合在弱阳离子WCX2芯片上的血清蛋白进行读取分析，设定最高检测相对分子质量为50*103，优化范围为2*103-10*103，激光强度190，检测敏感度为8。考虑到基质峰的存在，将1*103以下的峰滤去，以免基质峰对结果造成干扰。
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1.5统计学处理
实验数据采用Ciphergen Proteinchip 3.1版本的分析软件自动分析处理，P
2 讨论
20世纪最伟大的科学成就之一是发现了基因和基因技术的发展，作为功能基因的直接体现者——蛋白质，是生命活动和生物结构最主要的实际承担者。蛋白质组学研究能提供更多的生命信息，可在更深人、更贴近生命本质层次去发现和理解生命活动规律，以及重要生理、病理现象的本质。美国Ciphergen公司生产的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(sELDI-TOF)是蛋白质组学研究的一种高新生物技术分析手段，促使蛋白质的研究不断趋于科学化并向纵深发展。
SELDI-TOF蛋白质谱技术可用于检测未知蛋白并获取指纹图谱，检测时将标本(血清、尿液、细胞培养液等)直接加入芯池，样品中蛋白与特定探针结合后，在原位洗去非特异结合物质，再加人能量吸收剂(与蛋白形成混合结晶，促进蛋白质的解析附和离子化)，经室温自然干燥后上机检测。样品中蛋白质经激光脉冲辐射解析形成荷电离子，不同质荷比的离子在仪器场中飞行时间不同，检测器可将其捕获并绘制成质谱图，经计算机软件处理获得蛋白质的相对分子质量、含量等信息，并可直观地以扫描图谱、电泳样图谱或棒图的形式展示。SELDI-TOF蛋白质谱技术的特点及优势分析为：(1)可直接用血清、尿液、脑脊液、细胞培养液或组织抽提物等进行分析；(2)可进行高通量、自动化检测的自由选择，每次可准备8、24、96或192个样品；(3)对样品需要量极少，只需血清0.5-5 μl或2000个细胞； (4)可快速获取实验结果，对一条8孔芯片的阅读时间约为5 min；(5)检测灵敏度可高达1 fmol(10-15 mol)，适合那些低丰度、小分子量蛋白的发现；(6)可检测的相对分子质量达0-500 000；(7)可用于发现与疾病相关的一种蛋白或生物标记物或一组蛋白质，从而提供疾病诊断的最佳组合指标。
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四氧化二氮是我国“神州号”飞船助推火箭加注的推进剂之一，研究发现N2O4中毒以急性肺水肿为主要病理学变化，75%大鼠出现了肺纤维化，病理报告还发现肺腺癌。中毒致急性肺水肿的发生、发展机制的报道。因此，笔者在原有实验研究的基础上，制作N2O4中毒致急性肺水肿的动物模型，并采用SELDI-TOF技术对其血清进行蛋白质谱分析，寻找到了与N2O4中毒致急性肺水肿的相关蛋白，研究发现相对分子质量为3668、3870、4728、4900、5815的一组标志蛋白表达明显升高，相对分子质量为13 619、13 816两者的标志蛋白表达明显降低。本实验结论为本课题进一步阐明N2O4中毒致急性肺水肿发生机制，寻找与发生肺纤维化和肺部肿瘤的血清标志蛋白提供了研究方向。, http://www.100md.com(李建忠)
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[关键词]四氧化二氮；中毒；血清标志分子
四氧化二氮(N2O4)是双组元液体火箭推进剂之一，常温呈气态，极易挥发，在火箭及导弹发射等环节中，容易吸人人体造成急性肺损伤。动物实验研究表明，N2O4中毒以急性肺水肿为主要病理学变化，但其致伤机制尚待进一步研究。因此，笔者在原有实验研究的基础上，制作N2O4中毒致急性肺水肿的动物模型，采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(SELDI-TOF)进行血清蛋白组学研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作
ICR小鼠，体重20-25 g，由北京大学实验动物中心提供，随机分为对照组和模型组，每组8只。染毒模型制作方法：将动物置于军事医学科学院提供的120 L染毒柜中，使用100μl微量注射器定量抽取液态N2O4，注入120 L染毒柜中。染毒柜内备微型电扇，以保证推进剂充分蒸发及均匀分布，维持染毒柜内N2O4质量浓度为70 g/m3染毒时间15 min，室内温度保持在15℃。
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1.2动物中毒表现
动物染毒后，出现呼吸道、眼睛的刺激症状.流涎，呕吐，紫绀、呼吸困难、躁动、肌肉颤动、肢体抽搐。典型者突然出现四肢痉挛，牙关紧闭、屏息、口吐白沫、大小便失禁。
1.3蛋白组学分析
1.3.1蛋白飞行质谱仪 为美国Ciphergen公司生产，型号PBSII-c，实际上是一台表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(sELDI-TOF)。
1.3.2 试剂 尿素、乙腈、三氟乙酸、Tris-HCL9.0、CHAPS、DTF、NaAc、HPLCH2O、Hepes等均购自Sigma公司。
1.3.3 蛋白质芯片 为化学修饰的WCX2，芯片，其表面结合了弱阴型离子羧基，可以和被分析物表面的正电荷基团相互作用(如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)而捕获蛋白，可用于检测高等电点的蛋白质和生物标记分子。
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1.3.4 血清样品处理 从-70℃冰箱中取出血清，在4℃，10 000 r/min离心2 min。取3μl血清样品，加6μl处理液，充分混匀，冰浴振荡30 min后取出，加入108μl结合缓冲液，立即混匀。
1.3.5 上样及洗脱 将WCX2芯片装入Bioprocessor中，每孑L加入200μl结合缓冲液，室温振荡洗涤2次，每次5 min，甩干。每孔分别加入100μl样品混合液，振荡孵育l h，甩去样品，用200μl洗脱缓冲液室温振荡洗涤两次，每次5 min，甩干；再用HPLC H2O洗涤一次，立即甩干。拆开Bioprocessor，取出芯片，晾干后，每点点加两次0.5μl SPA，晾干后即可上机测量。
1.4数据采集
采用蛋白飞行质谱仪(PBSII-C型)对结合在弱阳离子WCX2芯片上的血清蛋白进行读取分析，设定最高检测相对分子质量为50*103，优化范围为2*103-10*103，激光强度190，检测敏感度为8。考虑到基质峰的存在，将1*103以下的峰滤去，以免基质峰对结果造成干扰。
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1.5统计学处理
实验数据采用Ciphergen Proteinchip 3.1版本的分析软件自动分析处理，P
2 讨论
20世纪最伟大的科学成就之一是发现了基因和基因技术的发展，作为功能基因的直接体现者——蛋白质，是生命活动和生物结构最主要的实际承担者。蛋白质组学研究能提供更多的生命信息，可在更深人、更贴近生命本质层次去发现和理解生命活动规律，以及重要生理、病理现象的本质。美国Ciphergen公司生产的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(sELDI-TOF)是蛋白质组学研究的一种高新生物技术分析手段，促使蛋白质的研究不断趋于科学化并向纵深发展。
SELDI-TOF蛋白质谱技术可用于检测未知蛋白并获取指纹图谱，检测时将标本(血清、尿液、细胞培养液等)直接加入芯池，样品中蛋白与特定探针结合后，在原位洗去非特异结合物质，再加人能量吸收剂(与蛋白形成混合结晶，促进蛋白质的解析附和离子化)，经室温自然干燥后上机检测。样品中蛋白质经激光脉冲辐射解析形成荷电离子，不同质荷比的离子在仪器场中飞行时间不同，检测器可将其捕获并绘制成质谱图，经计算机软件处理获得蛋白质的相对分子质量、含量等信息，并可直观地以扫描图谱、电泳样图谱或棒图的形式展示。SELDI-TOF蛋白质谱技术的特点及优势分析为：(1)可直接用血清、尿液、脑脊液、细胞培养液或组织抽提物等进行分析；(2)可进行高通量、自动化检测的自由选择，每次可准备8、24、96或192个样品；(3)对样品需要量极少，只需血清0.5-5 μl或2000个细胞； (4)可快速获取实验结果，对一条8孔芯片的阅读时间约为5 min；(5)检测灵敏度可高达1 fmol(10-15 mol)，适合那些低丰度、小分子量蛋白的发现；(6)可检测的相对分子质量达0-500 000；(7)可用于发现与疾病相关的一种蛋白或生物标记物或一组蛋白质，从而提供疾病诊断的最佳组合指标。
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四氧化二氮是我国“神州号”飞船助推火箭加注的推进剂之一，研究发现N2O4中毒以急性肺水肿为主要病理学变化，75%大鼠出现了肺纤维化，病理报告还发现肺腺癌。中毒致急性肺水肿的发生、发展机制的报道。因此，笔者在原有实验研究的基础上，制作N2O4中毒致急性肺水肿的动物模型，并采用SELDI-TOF技术对其血清进行蛋白质谱分析，寻找到了与N2O4中毒致急性肺水肿的相关蛋白，研究发现相对分子质量为3668、3870、4728、4900、5815的一组标志蛋白表达明显升高，相对分子质量为13 619、13 816两者的标志蛋白表达明显降低。本实验结论为本课题进一步阐明N2O4中毒致急性肺水肿发生机制，寻找与发生肺纤维化和肺部肿瘤的血清标志蛋白提供了研究方向。, http://www.100md.com(李建忠)