早期切痂对烧伤大鼠肺组织核因子－ＫＢ活化的影响
[摘要]目的探讨大鼠烧伤后早期切痂对肺组织核因子-kB(NF-kB)活化和促炎细胞因子表达的影响，进一步阐明烧伤早期切痂有利于控制全身炎症反应的机制。方法 采用wistar大鼠Ⅲ35%TBSA烧伤模型，实验分正常对照组(A组)、烧伤后非切痂组(B组)和烧伤后早期切痂组(c组)。大鼠烧伤后12、24 h凝胶电泳迁移率分析法(EMsA)检测肺组织NF-kB活性；逆转录-聚合酶链式反应(RT-PcR)检测肺组织TNF-a mRNA表达；酶联免疫吸附分析(ELIsA)检测肺组织TNF-a含量。数据采用Excel统计分析软件行t检验。结果B组大鼠伤后12、24 h肺组织NF-kB活性分别为(19.56±1.36)*104积分灰度值(A)和(15.23±1.94)*104A，均明显高于A组[(4.36±0.38)*l104A，P4 A，24 h为(6.33±0.90)*104 A，分别较B组显著降低(P32P]ATP(北京亚会辉公司)，PTC-200 DNA扩增仪(美国gene公司)，电泳仪、电转仪、干胶仪、真空泵(美国Bio-Rad公司)。PCR引物由上海生物工程公司合成，TNF-a上游引物5'-ATGAGC ACA GAA AGC ATG ATC CGC-3'，下游引物5'-CCA AAG TAG ACC TGC CCG AGA CTC-3'；β肌动蛋白上游引物5'-TGT ACG TAG CCA TCC AGG CT-3'，下游引物5'-TIC TCC AGG GAC GAA GAG GA-3'。
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1.2实验动物模型与分组
健康雄性Wistar大鼠，体重180-250 g，由本校动物实验中心提供。随机将实验动物分为正常对照组(A组)、烧伤后非切痂组(B组)和烧伤后早期切痂组(c组)，每时相点10只动物。烧伤动物麻醉后，背部脱毛，置于100℃恒温水浴中15s，制作35%TBSAⅢ度烫伤大鼠模型。烧伤后给予生理盐水3 ml/kg l%烧伤面积腹腔注射抗休克，伤后即刻和伤后4 h共注入总量的一半，伤后8、12、16、24 h共注入总量的另一半。烧伤后早期切痂组在烫伤后30 min内将烧伤皮肤组织全部切除，并立即用正常异体大鼠皮肤覆盖。对照组除烫伤外余处理同烧伤组。
1.3肺组织NF-KB活性检测
采用凝胶电泳迁移率(EMSA)法，提取肺组织核蛋白后，依EMSA试剂盒说明书进行。最后将显影结果经扫描仪输入电脑，用电泳区带分析软件ImageT001分析蛋白区带，并用积分灰度值(A)表示。
, 百拇医药
1.4肺组织TNF-a mRNA表达
参照Tripure RNA提取盒说明书进行肺组织RNA提取，再进行RT-PCR扩展。结果以TNF-a与β肌动蛋白的吸光度(A)值之比表示。
1.5组织匀浆中TNF-a检测
采用ELISA检测，按试剂检测盒说明书进行。
1.6统计学处理
计量资料以均数±标准差(x±s)表示，并采用Excel统计分析软件行t检验，以P4 A，B组伤后12、24 h大鼠肺组织NF-kB活性较A组明显增强(P4A x±s)注：与B组比较，P
2.2大鼠烧伤后肺组织TNF-a(mRNA表达和含量变化
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A组大鼠肺组织TNF-a mRNA表达为(0.28±0.04)，匀浆中TNF-a含量为(0.62±0.05)ng/ml。B组伤后12、24 h大鼠肺组织TNF-a mRNA表达和匀浆中TNF-a含量较A组明显增多(P
3 讨论
烧伤后炎性细胞因子呈“级联”失控性释放导致组织损害和脏器功能损害是全身炎症反应发展的结果，如何有效地抑制或阻断其发生与发展一直倍受重视。效应细胞释放细胞因子的关键环节在于mRNA转录调控，而最具“瓶颈”调控作用的是核转录因子，其中最具普遍作用的是NF-kB。NF-kB是一种快速反应的转录调节因子，几乎存在于所有细胞中，能调控许多细胞因子、趋化因子、粘附因子、生长因子、免疫受体等的生成，是基因发挥作用必须通过的基因开关，在全身炎症反应和多脏器功能损害的发生和发展中起重要作用。抑制NF-kB活性，从而下调众多的炎性细胞因子表达成为目前预防、治疗全身炎症反应和脏器组织损害的希望和策略。大面积烧伤早期切痂封闭创面，可有效地从源头阻断全身炎症反应和脏器损害。本研究显示烧伤早期切痂能有效抑制肺组织NF-kB活化，降低肺组织TNF-a的表达，提示烧伤后早期切痂对机体全身炎症反应的防治作用可能与抑制脏器NF-kB活化有关。
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烧伤创面是严重烧伤后炎症反应的主要发病原因。大面积烧伤遗留大量的损伤或坏死组织，皮肤烧伤可合成一种脂蛋白复合物“烧伤毒素”，释放TNF-a、高迁移率族蛋白B1等促炎细胞因子。烧伤后创面“毒性产物”主要经痂下水肿液回吸收而作用于机体远隔脏器，痂下水肿液中富含“烧伤毒素”，内毒素及TNF-a等，可导致全身炎症反应和多脏器损害的发生，因此，烧伤创面是伤后炎症反应的启动器官。烧伤后早期切痂在切除了大量坏死组织的同时引流了大痂下水肿液，减少了坏死组织、内毒素、TNF-a等众多诱导组织细胞NF—kB活化的刺激因素，从而从根本上去除了诱导机体效应细胞NF-kB活化的众多刺激因素。
众多参与急性肺损伤炎症反应的细胞因子均含有一个或多个kB序列，NF-kB对其转录表达起关键的调控作用TNF-a作为主要的前炎细胞因子，NF-kB是TNF-a转录表达的关键调控转录因子。本研究显示烧伤早期切痂可降低肺组织NF—KB活性，减少肺组织TNF-a mRNA和蛋白质的表达，两者呈显著正相关，进一步提示烧伤早期切痂可能通过抑制机体效应细胞NF-kB活化，下调TNF-a等细胞因子的释放，从而阻断或减轻由于大量细胞因子释放导致的全身炎症反应综合征。这是目前减轻烧伤后炎症反应、防治创面脓毒血症的关键措施。, http://www.100md.com(李志清)
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1.2实验动物模型与分组
健康雄性Wistar大鼠，体重180-250 g，由本校动物实验中心提供。随机将实验动物分为正常对照组(A组)、烧伤后非切痂组(B组)和烧伤后早期切痂组(c组)，每时相点10只动物。烧伤动物麻醉后，背部脱毛，置于100℃恒温水浴中15s，制作35%TBSAⅢ度烫伤大鼠模型。烧伤后给予生理盐水3 ml/kg l%烧伤面积腹腔注射抗休克，伤后即刻和伤后4 h共注入总量的一半，伤后8、12、16、24 h共注入总量的另一半。烧伤后早期切痂组在烫伤后30 min内将烧伤皮肤组织全部切除，并立即用正常异体大鼠皮肤覆盖。对照组除烫伤外余处理同烧伤组。
1.3肺组织NF-KB活性检测
采用凝胶电泳迁移率(EMSA)法，提取肺组织核蛋白后，依EMSA试剂盒说明书进行。最后将显影结果经扫描仪输入电脑，用电泳区带分析软件ImageT001分析蛋白区带，并用积分灰度值(A)表示。
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参照Tripure RNA提取盒说明书进行肺组织RNA提取，再进行RT-PCR扩展。结果以TNF-a与β肌动蛋白的吸光度(A)值之比表示。
1.5组织匀浆中TNF-a检测
采用ELISA检测，按试剂检测盒说明书进行。
1.6统计学处理
计量资料以均数±标准差(x±s)表示，并采用Excel统计分析软件行t检验，以P4 A，B组伤后12、24 h大鼠肺组织NF-kB活性较A组明显增强(P4A x±s)注：与B组比较，P
2.2大鼠烧伤后肺组织TNF-a(mRNA表达和含量变化
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A组大鼠肺组织TNF-a mRNA表达为(0.28±0.04)，匀浆中TNF-a含量为(0.62±0.05)ng/ml。B组伤后12、24 h大鼠肺组织TNF-a mRNA表达和匀浆中TNF-a含量较A组明显增多(P
3 讨论
烧伤后炎性细胞因子呈“级联”失控性释放导致组织损害和脏器功能损害是全身炎症反应发展的结果，如何有效地抑制或阻断其发生与发展一直倍受重视。效应细胞释放细胞因子的关键环节在于mRNA转录调控，而最具“瓶颈”调控作用的是核转录因子，其中最具普遍作用的是NF-kB。NF-kB是一种快速反应的转录调节因子，几乎存在于所有细胞中，能调控许多细胞因子、趋化因子、粘附因子、生长因子、免疫受体等的生成，是基因发挥作用必须通过的基因开关，在全身炎症反应和多脏器功能损害的发生和发展中起重要作用。抑制NF-kB活性，从而下调众多的炎性细胞因子表达成为目前预防、治疗全身炎症反应和脏器组织损害的希望和策略。大面积烧伤早期切痂封闭创面，可有效地从源头阻断全身炎症反应和脏器损害。本研究显示烧伤早期切痂能有效抑制肺组织NF-kB活化，降低肺组织TNF-a的表达，提示烧伤后早期切痂对机体全身炎症反应的防治作用可能与抑制脏器NF-kB活化有关。
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烧伤创面是严重烧伤后炎症反应的主要发病原因。大面积烧伤遗留大量的损伤或坏死组织，皮肤烧伤可合成一种脂蛋白复合物“烧伤毒素”，释放TNF-a、高迁移率族蛋白B1等促炎细胞因子。烧伤后创面“毒性产物”主要经痂下水肿液回吸收而作用于机体远隔脏器，痂下水肿液中富含“烧伤毒素”，内毒素及TNF-a等，可导致全身炎症反应和多脏器损害的发生，因此，烧伤创面是伤后炎症反应的启动器官。烧伤后早期切痂在切除了大量坏死组织的同时引流了大痂下水肿液，减少了坏死组织、内毒素、TNF-a等众多诱导组织细胞NF—kB活化的刺激因素，从而从根本上去除了诱导机体效应细胞NF-kB活化的众多刺激因素。
众多参与急性肺损伤炎症反应的细胞因子均含有一个或多个kB序列，NF-kB对其转录表达起关键的调控作用TNF-a作为主要的前炎细胞因子，NF-kB是TNF-a转录表达的关键调控转录因子。本研究显示烧伤早期切痂可降低肺组织NF—KB活性，减少肺组织TNF-a mRNA和蛋白质的表达，两者呈显著正相关，进一步提示烧伤早期切痂可能通过抑制机体效应细胞NF-kB活化，下调TNF-a等细胞因子的释放，从而阻断或减轻由于大量细胞因子释放导致的全身炎症反应综合征。这是目前减轻烧伤后炎症反应、防治创面脓毒血症的关键措施。, http://www.100md.com(李志清)