哮喘小鼠胸腺活化调节趋化因子及其受体的表达(1)
[摘要]目的 探讨胸腺活化调节趋化因子(TARc)及其受体CCR4在哮喘小鼠气道炎症中的作用。方法 清洁级健康雄性Balb/c小鼠20只随机分成两组，分别为对照组、哮喘组。以卯清白蛋白(OVA)致敏和激发建立小鼠哮喘模型。末次激发24 h后留取血液、支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织。BALF行细胞计数及分类；应用酶联免疫吸附试验(ELIsA)法测定BALF和血清中TARC和白介素(IL)-4蛋白的浓度；光镜观察肺组织病理变化；逆转录一聚合酶链反应(RT-PcR)法测定肺组织中TARc mRNA、ccR4 mRNA的表达；采用免疫组织化学法测定肺组织中TARc蛋白的表达。结果 哮喘组BALF和血清中TARc的浓度[分别为(458.36±114.98)pg/ml、(145.56±28.38)pg/m1]均显著高于对照组[分别为(5.06±2.38)pg/ml、(73.79±29.27)pg/mi](P+T淋巴细胞在支气管哮喘(哮喘)的病理生理中起重要作用。Th2细胞分泌的细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等促进IgE的合成及嗜酸性粒细胞(EOS)在气道聚集、脱颗粒、释放嗜酸粒细胞阳离子蛋白等导致气道炎症和气道高反应，同时伴有气道黏液高分泌，因此Th2细胞募集至肺是启动和扩大气道炎症发生发展的直接因素。但Th2细胞从血液迁移到气道炎症部位的机制目前尚未完全清楚。胸腺活化调节趋化因子(thymus and activation-regulated chemokine，TARC)是发现的一个新的CC趋化因子，其特异性受体为CCR4，具有趋化Th2细胞从外周血募集至炎症部位的作用。本研究通过建立哮喘小鼠模型，研究TARC及其受体CCR4在哮喘中的表达情况，以深入揭示TARC及CCR4在哮喘气道炎症中的作用机制。
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1 材料与方法
1.1 实验动物及材料
清洁级健康雄性Balb/c小鼠20只，4-6周龄，体重18-22 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。卵清白蛋白(OVA)V级(sigma，USA)；小鼠TARC ELISA试剂盒(R&D，USA)；IL-4ELISA试剂盒(Bender Medsystems)；山羊抗小鼠TARC多克隆抗体(santa Cruz，USA)；RT-PCR试剂盒(Fermentas，USA)；Trizol抽提试剂(Invitrogen，USA)；TARC、CCR4和GAPDH引物(上海生物工程有限公司)。空气压缩雾化器(PARI BOY N038，GERMAN)；酶标仪(ELX 808IUBio-TEK，USA)；PCR仪(Biometra，GERMAN)。
1.2动物分组及模型复制
采用随机表法将小鼠分成两组，每组10只，分别为对照组、哮喘组。第1天和第14天腹腔注射0.5%OVA/A1(OH)3混合液0.2 ml，内含OVA0.1 mg和Al(OH)310 mg，致敏，各1次。第25天开始将哮喘组动物置于自制密闭有机玻璃箱(30 em×30 cm×30 cm)中，使用空气压缩雾化器向箱内小鼠喷雾1%OVA液激发，每天1次，每次持续30 min，连续1周。正常对照组致敏和激发均以生理盐水替代OVA。
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1.3标本的留取
末次激发24 h后，用10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，用镊子摘眼球取血，血液凝固后以2000 r/min速度离心20 min，吸取血清分装，-80℃保存待检。颈前暴露气管，做一横形切口，插入20 G留置针管，夹住左肺门根部，右肺行支气管肺泡灌洗，用1.5 mL PBS缓冲液分3次灌洗，回收率在80%以上，收集于离心管中，置于冰块中。BALF离心(2000 r/min，4℃)10 min后，取上清液-80℃保存备用，沉淀用PBS重悬，用于细胞计数和分类。肺组织标本的制备采用高温(180℃)灭RNA酶的剪刀和镊子取左肺组织，于靠近左肺门处切取肺组织厚约2-3 mm作冰冻切片免疫组化用，余肺肺组织备RNA抽提，分别包好后迅速丢入液氮速冻后，保存在-80%冰箱。右肺灌洗后注入4%多聚甲醛固定，常规脱水，透明，浸蜡包埋，制作蜡块备检。
1.4 BALF中细胞计数
, http://www.100md.com 将BALF沉渣用PBS重悬，计数细胞总数使用1%-2%的冰醋酸稀释液，细胞分类计数使用瑞氏染色液，EOS绝对值计数用伊红染液。
1.5 BALF和血清中TARC和IL-4浓度的检测
采用ELISA法测TARC和IL-4的浓度，按试剂盒说明书具体操作。
1.6支气管TARC蛋白表达的检测
使用免疫组化sP法检测。一抗稀释度1:150，3，3.二氨基苯联胺(DAB)显色，苏木素复染，阳性细胞呈棕黄色。每张切片随机选择至少5个高倍视野，在高倍光镜(×400)测量阳性部位的吸光度，取其平均值代表该小鼠的表达水平。
1.7肺组织TARC mRNA、CCR4 mRNA表达的
检测
肺组织总RNA提取及逆转录过程，按试剂盒的说明书进行操作，cDNA于一20℃保存备用。PCR扩增引物序列如下： (1)TARC：5'-CAGGAAGq37GGTGAGCTGGTATA-3'，5'-TYGTGTI'CGCCTGTAGTGCATA-3；(2)CCR4：5'-CGACGATYCCAAAGATGA-3'，5'-TCCAAACAGACCCAACAA-3'； (3)GAPDH：5'-AGTATGACTCCACTCACGGCAA-3'，5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3'。反应体系为：cDNA lμl，10*PCR buffer 2.0μl，25 mol/L MgCl，1.2 μl，10 mmol/
[ 下 页 ], http://www.100md.com(李昌崇)
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1.1 实验动物及材料
清洁级健康雄性Balb/c小鼠20只，4-6周龄，体重18-22 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。卵清白蛋白(OVA)V级(sigma，USA)；小鼠TARC ELISA试剂盒(R&D，USA)；IL-4ELISA试剂盒(Bender Medsystems)；山羊抗小鼠TARC多克隆抗体(santa Cruz，USA)；RT-PCR试剂盒(Fermentas，USA)；Trizol抽提试剂(Invitrogen，USA)；TARC、CCR4和GAPDH引物(上海生物工程有限公司)。空气压缩雾化器(PARI BOY N038，GERMAN)；酶标仪(ELX 808IUBio-TEK，USA)；PCR仪(Biometra，GERMAN)。
1.2动物分组及模型复制
采用随机表法将小鼠分成两组，每组10只，分别为对照组、哮喘组。第1天和第14天腹腔注射0.5%OVA/A1(OH)3混合液0.2 ml，内含OVA0.1 mg和Al(OH)310 mg，致敏，各1次。第25天开始将哮喘组动物置于自制密闭有机玻璃箱(30 em×30 cm×30 cm)中，使用空气压缩雾化器向箱内小鼠喷雾1%OVA液激发，每天1次，每次持续30 min，连续1周。正常对照组致敏和激发均以生理盐水替代OVA。
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末次激发24 h后，用10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，用镊子摘眼球取血，血液凝固后以2000 r/min速度离心20 min，吸取血清分装，-80℃保存待检。颈前暴露气管，做一横形切口，插入20 G留置针管，夹住左肺门根部，右肺行支气管肺泡灌洗，用1.5 mL PBS缓冲液分3次灌洗，回收率在80%以上，收集于离心管中，置于冰块中。BALF离心(2000 r/min，4℃)10 min后，取上清液-80℃保存备用，沉淀用PBS重悬，用于细胞计数和分类。肺组织标本的制备采用高温(180℃)灭RNA酶的剪刀和镊子取左肺组织，于靠近左肺门处切取肺组织厚约2-3 mm作冰冻切片免疫组化用，余肺肺组织备RNA抽提，分别包好后迅速丢入液氮速冻后，保存在-80%冰箱。右肺灌洗后注入4%多聚甲醛固定，常规脱水，透明，浸蜡包埋，制作蜡块备检。
1.4 BALF中细胞计数
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1.5 BALF和血清中TARC和IL-4浓度的检测
采用ELISA法测TARC和IL-4的浓度，按试剂盒说明书具体操作。
1.6支气管TARC蛋白表达的检测
使用免疫组化sP法检测。一抗稀释度1:150，3，3.二氨基苯联胺(DAB)显色，苏木素复染，阳性细胞呈棕黄色。每张切片随机选择至少5个高倍视野，在高倍光镜(×400)测量阳性部位的吸光度，取其平均值代表该小鼠的表达水平。
1.7肺组织TARC mRNA、CCR4 mRNA表达的
检测
肺组织总RNA提取及逆转录过程，按试剂盒的说明书进行操作，cDNA于一20℃保存备用。PCR扩增引物序列如下： (1)TARC：5'-CAGGAAGq37GGTGAGCTGGTATA-3'，5'-TYGTGTI'CGCCTGTAGTGCATA-3；(2)CCR4：5'-CGACGATYCCAAAGATGA-3'，5'-TCCAAACAGACCCAACAA-3'； (3)GAPDH：5'-AGTATGACTCCACTCACGGCAA-3'，5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3'。反应体系为：cDNA lμl，10*PCR buffer 2.0μl，25 mol/L MgCl，1.2 μl，10 mmol/
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