促红细胞生成素对大剂量异丙肾上腺素所致心肌损伤及细胞凋亡的作用(1)
[摘要]目的 观察促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)对异丙肾上腺素(isoproterenol.ISO)引起大鼠心肌损伤及心肌细胞凋亡相关基因表达的影响。方法 将雄性Sprague-Dawley(sD)大鼠分为3组：对照组、ISO组和EPO治疗组，检测血肌酸激酶、肌酸激酶同工酶水平及心肌caspase-3、iNOS的蛋白表达变化。结果 EPO治疗组心肌酶水平及easpase-3、iNOS的蛋白表达均较ISO组明显减低。结论促红细胞生成素可以显著减轻异丙。肾上腺素引起的心肌损伤，抑制caspase-3、iNOS蛋白表达。
[关键词]促红细胞生成素；心肌损伤；凋亡；Caspase-3；iNOS
心血管疾病的发病率逐年增高，目前已经逐渐成为我国城乡居民的第一位死因，因此研究心肌的保护显得尤为迫切。近年来发现促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)除治疗由各种原因引起的贫血外，还在心血管系统中的细胞中起保护作用。笔者采用大剂量异丙’肾上腺素腹腔注射的方法造成大鼠心肌损伤的在体动物模型，并对其进行EPO的干预，从中探讨EPO对心脏的保护作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 心肌损伤大鼠模型建立及分组
用大剂量异丙肾上腺素(ISO)腹腔注射一次建立大鼠心肌损伤模型。60只清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重(219.36±16.27)g，随机分成三组：(1)ISO组 20只，以ISO 50mg/kg腹腔注射一次；(2)EPO治疗组20只，以ISO 50 rag/kg腹腔注射一次后30 min时用EPO(5000 U/kg)腹腔注射一次；(3)对照组20只，用等量生理盐水代替ISO腹腔注射。
1.2标本采集
各组大鼠均于最后一次腹腔注射后24 h在氯氨酮麻醉下固定，开腹采腹主动脉血约4 ml检测磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸同工酶(CKMB)，处死大鼠，取出心脏。
, 百拇医药 1.3主要试剂与仪器
重组人红细胞生成素(rhEPO)(商品名：依普定)为山东科兴生物制品有限公司生产。盐酸异丙肾上腺素(Isopmterenol，ISO)为上海禾丰制药有限公司生产。心肌酶试剂盒由美国Beckman公司生产。抗半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)抗体为兔抗抗体(1:50)、抗诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)抗体为兔抗抗体(1:50)和即用型SABC试剂盒均购自武汉博士德生物科技有限公司(美国Santa Cruz chnology，Inc生产)。DAB酶底物显色试剂盒为福州迈新生物技术开发公司生产。Beckman-Coulter CXT8全自动生化分析仪，日本Olympus光学显微镜。
1.4方法
腹主动脉取血离心后取血清在全自动生化分析仪上以速率法测定CK含量，以免疫抑制法测定CKMB含量。免疫组织化学测定Caspase-3、iNOS基因蛋白表达，用SABC试剂盒检测。心肌组织中性甲醛固定后石蜡包埋，室温5-10 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次，热修复抗原后滴加5%BSA封闭液，室温20 min后滴加适当稀释的一抗Caspase-3(或iNOS)(1:50)，40℃过夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG，滴加试剂SABC，DAB显色，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜观察。
, http://www.100md.com
1.5 SABC免疫组化染色阳性表达判定
Caspase-3蛋白阳性反应为黄色至棕褐色颗粒散在或弥漫状分布，主要定位于细胞浆少数定位于细胞核。免疫组织化学切片于光镜下400倍放大，随机选择10个无重叠视野，计数每个视野下阳性细胞数，然后计算出阳性染色的细胞占总细胞数的百分比(positive index，PI)。
PI(%)：阳性细胞数/视野所有细胞总数*100%。
iNOS蛋白阳性反应为黄色至棕褐色颗粒，定位于细胞浆，按上述同样方法计算出PI。
1.6统计学处理
本实验所有计量资料均采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，计数资料统计采用Y2检验，使用SPSS 12.0软件进行统计学处理以P
注：ISO组与对照组比较，P
注：与对照组比较，P
[ 下 页 ], 百拇医药(韩 芳)
[关键词]促红细胞生成素；心肌损伤；凋亡；Caspase-3；iNOS
心血管疾病的发病率逐年增高，目前已经逐渐成为我国城乡居民的第一位死因，因此研究心肌的保护显得尤为迫切。近年来发现促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)除治疗由各种原因引起的贫血外，还在心血管系统中的细胞中起保护作用。笔者采用大剂量异丙’肾上腺素腹腔注射的方法造成大鼠心肌损伤的在体动物模型，并对其进行EPO的干预，从中探讨EPO对心脏的保护作用。
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1 材料与方法
1.1 心肌损伤大鼠模型建立及分组
用大剂量异丙肾上腺素(ISO)腹腔注射一次建立大鼠心肌损伤模型。60只清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重(219.36±16.27)g，随机分成三组：(1)ISO组 20只，以ISO 50mg/kg腹腔注射一次；(2)EPO治疗组20只，以ISO 50 rag/kg腹腔注射一次后30 min时用EPO(5000 U/kg)腹腔注射一次；(3)对照组20只，用等量生理盐水代替ISO腹腔注射。
1.2标本采集
各组大鼠均于最后一次腹腔注射后24 h在氯氨酮麻醉下固定，开腹采腹主动脉血约4 ml检测磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸同工酶(CKMB)，处死大鼠，取出心脏。
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重组人红细胞生成素(rhEPO)(商品名：依普定)为山东科兴生物制品有限公司生产。盐酸异丙肾上腺素(Isopmterenol，ISO)为上海禾丰制药有限公司生产。心肌酶试剂盒由美国Beckman公司生产。抗半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)抗体为兔抗抗体(1:50)、抗诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)抗体为兔抗抗体(1:50)和即用型SABC试剂盒均购自武汉博士德生物科技有限公司(美国Santa Cruz chnology，Inc生产)。DAB酶底物显色试剂盒为福州迈新生物技术开发公司生产。Beckman-Coulter CXT8全自动生化分析仪，日本Olympus光学显微镜。
1.4方法
腹主动脉取血离心后取血清在全自动生化分析仪上以速率法测定CK含量，以免疫抑制法测定CKMB含量。免疫组织化学测定Caspase-3、iNOS基因蛋白表达，用SABC试剂盒检测。心肌组织中性甲醛固定后石蜡包埋，室温5-10 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次，热修复抗原后滴加5%BSA封闭液，室温20 min后滴加适当稀释的一抗Caspase-3(或iNOS)(1:50)，40℃过夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG，滴加试剂SABC，DAB显色，苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜观察。
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1.5 SABC免疫组化染色阳性表达判定
Caspase-3蛋白阳性反应为黄色至棕褐色颗粒散在或弥漫状分布，主要定位于细胞浆少数定位于细胞核。免疫组织化学切片于光镜下400倍放大，随机选择10个无重叠视野，计数每个视野下阳性细胞数，然后计算出阳性染色的细胞占总细胞数的百分比(positive index，PI)。
PI(%)：阳性细胞数/视野所有细胞总数*100%。
iNOS蛋白阳性反应为黄色至棕褐色颗粒，定位于细胞浆，按上述同样方法计算出PI。
1.6统计学处理
本实验所有计量资料均采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，计数资料统计采用Y2检验，使用SPSS 12.0软件进行统计学处理以P
注：ISO组与对照组比较，P
注：与对照组比较，P
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