眼镜蛇毒因子对创伤失血性休克大鼠肠道的作用(1)
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摘要：目的观察眼镜蛇毒因子(CVF)抑制补体激活对创伤失血性休克大鼠肠道的影响。方法雄性sD大鼠建立创伤失血性休克模型，随机分成对照组和CVF组，根据观察时间点的不同各组再分为休克前、复苏后1、6、24h时相组。结果对照组大鼠复苏后1h血总补体活性(cH)水平迅速下降，血内毒素(LPS)浓度、肠黏膜损伤评分均明显升高，随后2个时间点快速恢复至休克前水平；二胺氧化酶(DAO)活性在随后1h和6h时相明显升高，然后快速下降。CVF组大鼠除CH水平始终
1 材料与方法
1.1试剂
纯化的CVF试剂(中国科学院天然产物化学重点实验室)；内毒素检测试剂(E.coliolll：B4系瑞典Chmmogenix公司，PCA系日本生化工业株式会社)；DAO检测试剂(O-Dianisidine、戊二胺及DAO标准品系美国Sigma公司)；CPRS生理记录系统(南昌大学医学院功能中心)；紫外可见分光光度计(UV-3000，美国)。
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1.2动物分组
健康雄性SD大鼠80只(购于江西医学院动科部)，体重250～300g。随机分为对照组(40只)、CVF组(40只)。根据观察时间的不同各组再分为休克前，复苏后1，6，24h 4个时相组，对照组和CVF组各组每个时相组10只。CVF组于创伤前24h从大鼠阴茎背静脉注射CVF 50/μg/kg，对照组给予等量生理盐水。
1.3方法
大鼠用20%乌拉坦(1.0 g/kg)腹腔注射麻醉，股动脉和颈外静脉插管，CPRS生理记录系统通过三通管经股动脉监测血压及放血，静脉回输血液和等量乳酸林格氏液。用钳夹致对侧股骨中下1/3段闭合性骨折，骨折后5min，并立即经股动脉快速放血(约10min)，使MAP降至4～4.6kPa(30～35mmHg)，维持该水平60min，然后回输全部失血及等量的乳酸林格氏液复苏，复苏需30min，撤除插管，关闭切口。在实验中，动物被肝素化(100 U/kg，动脉注入)。对于两组中休克前时间点的动物，手术操作过程如上，但仅限于相应动、静脉插管，未行放血，不损伤其对侧骨。实验动物根据时间点的不同在麻醉及无菌条件下采血，分别留取门静脉、腔静脉血标本。门脉血分离血浆封人无热原安瓿中及下腔静脉血分离血清后贮存于-70℃冰箱中待测。
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1.3检测指标及方法
1.3.1血浆内毒素含量 采用改良过氯酸预处理血浆、基质显色法鲎试验定量测定法。
1.3.2血清二胺氧化酶(DAO)活性和总补体活性(CH50)测定分别采用分光光度法和CH50法测定。
1.3.3肠组织观察及评分肠组织标本用4%甲醛PBS(磷酸盐缓冲液)固定，4℃过夜，石蜡包埋、切片，将石蜡切片脱蜡至水，然后用苏木素染色，用水冲洗后再用伊红染色、风干封片，即可在光学显微镜下观察组织切片。采用盲法阅片并把见到的按四级评分系统(0～3分)对小肠损伤情况进行判定。
1.4统计学方法
计量资料以均数±标准差表示，统计学分析用SPSS(13.0版本)软件进行方差分析，q检验及相关分析方法，以P
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2.2 血二胺氧化酶(DAO)的变化
血中DAO来源于肠上皮细胞，其活性增加与细胞受损后的膜通透性升高及细胞坏死、脱落有关，能更直接地反映了小肠黏膜上皮细胞和由此构成的肠屏障结构的受损状况。实验中发现，对照组大鼠血清DAO浓度在休克复苏后迅速升高，复苏后1h明显升高(P50)的变化
对照组大鼠血清CH50水平在休克复苏后1h较休克前明显下降(P50活性显著降低，各时间点均降至5%以下。
2.4回肠组织变化
2.4.1 回肠组织的病理改变 光镜下观察可见，对照组中，休克前回肠黏膜结构完整，绒毛上皮无缺损，未见淋巴滤泡增生及炎症细胞浸润；复苏后1h组可见绒毛略有水肿，生长稀疏，可见淋巴滤泡增生及中性粒细胞浸润，血管扩张不明显；复苏后6h组可见大量绒毛脱落，残存绒毛明显水肿、稀疏、长短不一，固有层大量中性白细胞浸润及淋巴滤泡增生，部分血管呈扩张状态；复苏后24 h组损伤明显减轻，呈恢复状态，但仍可见局部淋巴滤泡增生，轻度炎细胞浸润。CVF组中，休克前组同上面休克前组，复苏后各时间点组均较对照组相应时间点组明显减轻。
2.4.2肠组织的组织学损伤评分采用四级评分系统(0～3分)对小肠损伤情况进行判定。0分：无损伤改变；0.5分：绒毛顶端的极小损伤；1分：绒毛上部轻度黏膜损伤；2分：几乎绒毛长
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