高压氧对大鼠T淋巴细胞和细胞因子的影响(2)
【Key words】Hyperbaric oxygen;Systematic inflammatory response syndrome;T- lymphocyte; Cytokine; Immune function ;TNF-α
高压氧(HBO)作为一种治疗手段，广泛应用于临床。它可以促进受伤部位纤维母细胞、上皮细胞和血管的增值，增强白细胞的氧化杀伤能力，对特殊厌氧菌有致命的杀伤力[1]。高压氧还表现出广泛的细胞分子学反应，包括细胞内信号转导和基因功能调节，高压氧的生化作用包括调节黏附分子、生长因子和细胞因子的表达，微循环的灌注和细胞能量的干预等[2]。然而，高压氧在免疫调节和抗炎作用方面的研究以及在全身炎症反应综合征(SIRS)中的应用尚不多见。SIRS从一个新的角度阐明多器官功能障碍综合征(MODS)的重要病理生理及发生发展过程。创伤、感染、休克发展到 MODS存在着一条共同通路，即SIRS[3]。本实验探讨高压氧作为辅助治疗手段对一些以炎症反应为病理基础的疾病是否具有普遍的治疗意义。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
健康雄性SD大鼠40只，体质量150～190 g。购自中国医科大学实验动物中心。酵母多糖-A(购自Sigma公司，美国)，细胞亚群的分析使用以下特殊的单克隆抗体：抗大鼠FITC-CD3，PE-CD4，PE-CD8(购自biolegend公司，美国)，TNF-α，IL-6，IL-10 的ELISA试剂盒购自欣博盛公司(R&D公司分装，美国)。
1.2 实验动物与分组
健康雄性SD大鼠40只随机(随机数字法)分为5组，每组8只。A组：腹腔注射生理盐水(0.9% NaCl, 5 ml/kg)作为对照组；B组：腹腔注射等量生理盐水(0.9%NaCl)，做3次高压氧(2ATA)治疗，时间分别为腹腔注射后4 h、10 h、18 h。C组：腹腔注射酵母多糖-石蜡悬液(500 mg/kg)；D组：腹腔注射等量酵母多糖-石蜡悬液，4 h以后做1次高压氧治疗(2ATA)；E组：腹腔注射等量酵母多糖-石蜡悬液后，做3次高压氧治疗(2ATA)，时间分别为腹腔注射后4、10、18 h。注射之前，酵母多糖-石蜡悬液于100 ℃水浴 80 min灭菌。饲养条件：温度(21±1 )℃，相对湿度60%。规律光照，7:00-19:00。自由进水和进食。
, 百拇医药
1.3 动物SIRS模型的建立及模型成功的标准
通过腹腔注射酵母多糖引起大鼠系统性炎症反应综合征，通过观察对比腹腔注射24 h后大鼠的呼吸频率增加50%，体温上升或下降1 ℃，以及皮肤发绀作为模型成功的标准。
1.4 高压氧治疗方案
在透明动物氧舱内(DWC400A/0.2-1，华信氧业有限公司，潍坊，山东)进行。加压之前，100%纯氧洗舱5 min，以清除舱内原有空气。匀速15 min加压至2ATA。所有的动物经过60 min的稳压治疗，之后以同样的速度减压出舱。治疗期间，舱内以4 L/min的速度通氧以避免CO2蓄积。
1.5 干预
所有大鼠均于固定时间点处死(腹腔注射后24 h)，乙醚麻醉，门静脉取血，血标本EDTA抗凝。以红细胞裂解液去除红细胞，采用流式细胞技术，以荧光标记抗体标准操作流程，对CD3+CD4+CD8+进行计数，使用中国医科大学中心实验室Becton/Dickenson FACScan型流式细胞仪，每个标本选取5000个细胞进行分析。血浆IL-6、IL-10、TNF-α按照ELISA试剂盒说明书操作进行。
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1.6 统计学方法
各组数值用均数±标准差(x±s )表示，运用SPSS 13.0 for Windows软件，以单因素方差分析及LSD-t检验对数据进行分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 酵母多糖对T细胞和细胞因子的影响
注射酵母多糖的大鼠CD4和CD8 T细胞均较对照组明显减少(P<0.01)，减少程度基本平行，所以CD3+CD4+/CD3+CD8+无变化(表1图1、2)。本实验中，只有部分大鼠出现细胞因子明显增多，其余与对照组比较无明显变化(表2、图3)。所以本研究将C组D组分别再分成C0和C1组、D0和D1组，C1同D1组作为亚组单独分析(图4)。
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2.2 高压氧对健康大鼠T细胞和细胞因子的影响
B组CD4 T细胞比例同对照组(A组)相比明显减少(P<0.01)，CD8 T细胞基本无变化，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值明显下降(P<0.05)(表1、图1、2)。高压氧明显增加IL-6 (P<0.05)和减少IL-10(P<0.01)。TNF-α基本无变化(表2、图3)。
2.3 高压氧对SIRS大鼠T细胞的影响
高压氧使酵母多糖导致的CD4T细胞减少明显恢复(P<0.05)。同高压氧对健康大鼠T细胞的影响一样，高压氧几乎不影响CD8 T细胞，故CD3+CD4+/CD3+CD8+比值升高(P<0.05)(表1、图1、2)。
2.4 高压氧对SIRS大鼠细胞因子的影响
一方面，与未产生高炎症反应的大鼠组(C0组)比较，三次高压氧(E组)明显增加IL-6(P<0.05)和TNF-α(P<0.01)，而减少IL-10(P<0.05)，这种影响类似于正常组大鼠(图3)。
, 百拇医药(刘志红 冯芳 王钢)
高压氧(HBO)作为一种治疗手段，广泛应用于临床。它可以促进受伤部位纤维母细胞、上皮细胞和血管的增值，增强白细胞的氧化杀伤能力，对特殊厌氧菌有致命的杀伤力[1]。高压氧还表现出广泛的细胞分子学反应，包括细胞内信号转导和基因功能调节，高压氧的生化作用包括调节黏附分子、生长因子和细胞因子的表达，微循环的灌注和细胞能量的干预等[2]。然而，高压氧在免疫调节和抗炎作用方面的研究以及在全身炎症反应综合征(SIRS)中的应用尚不多见。SIRS从一个新的角度阐明多器官功能障碍综合征(MODS)的重要病理生理及发生发展过程。创伤、感染、休克发展到 MODS存在着一条共同通路，即SIRS[3]。本实验探讨高压氧作为辅助治疗手段对一些以炎症反应为病理基础的疾病是否具有普遍的治疗意义。
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1 材料与方法
1.1 材料
健康雄性SD大鼠40只，体质量150～190 g。购自中国医科大学实验动物中心。酵母多糖-A(购自Sigma公司，美国)，细胞亚群的分析使用以下特殊的单克隆抗体：抗大鼠FITC-CD3，PE-CD4，PE-CD8(购自biolegend公司，美国)，TNF-α，IL-6，IL-10 的ELISA试剂盒购自欣博盛公司(R&D公司分装，美国)。
1.2 实验动物与分组
健康雄性SD大鼠40只随机(随机数字法)分为5组，每组8只。A组：腹腔注射生理盐水(0.9% NaCl, 5 ml/kg)作为对照组；B组：腹腔注射等量生理盐水(0.9%NaCl)，做3次高压氧(2ATA)治疗，时间分别为腹腔注射后4 h、10 h、18 h。C组：腹腔注射酵母多糖-石蜡悬液(500 mg/kg)；D组：腹腔注射等量酵母多糖-石蜡悬液，4 h以后做1次高压氧治疗(2ATA)；E组：腹腔注射等量酵母多糖-石蜡悬液后，做3次高压氧治疗(2ATA)，时间分别为腹腔注射后4、10、18 h。注射之前，酵母多糖-石蜡悬液于100 ℃水浴 80 min灭菌。饲养条件：温度(21±1 )℃，相对湿度60%。规律光照，7:00-19:00。自由进水和进食。
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1.3 动物SIRS模型的建立及模型成功的标准
通过腹腔注射酵母多糖引起大鼠系统性炎症反应综合征，通过观察对比腹腔注射24 h后大鼠的呼吸频率增加50%，体温上升或下降1 ℃，以及皮肤发绀作为模型成功的标准。
1.4 高压氧治疗方案
在透明动物氧舱内(DWC400A/0.2-1，华信氧业有限公司，潍坊，山东)进行。加压之前，100%纯氧洗舱5 min，以清除舱内原有空气。匀速15 min加压至2ATA。所有的动物经过60 min的稳压治疗，之后以同样的速度减压出舱。治疗期间，舱内以4 L/min的速度通氧以避免CO2蓄积。
1.5 干预
所有大鼠均于固定时间点处死(腹腔注射后24 h)，乙醚麻醉，门静脉取血，血标本EDTA抗凝。以红细胞裂解液去除红细胞，采用流式细胞技术，以荧光标记抗体标准操作流程，对CD3+CD4+CD8+进行计数，使用中国医科大学中心实验室Becton/Dickenson FACScan型流式细胞仪，每个标本选取5000个细胞进行分析。血浆IL-6、IL-10、TNF-α按照ELISA试剂盒说明书操作进行。
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1.6 统计学方法
各组数值用均数±标准差(x±s )表示，运用SPSS 13.0 for Windows软件，以单因素方差分析及LSD-t检验对数据进行分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 酵母多糖对T细胞和细胞因子的影响
注射酵母多糖的大鼠CD4和CD8 T细胞均较对照组明显减少(P<0.01)，减少程度基本平行，所以CD3+CD4+/CD3+CD8+无变化(表1图1、2)。本实验中，只有部分大鼠出现细胞因子明显增多，其余与对照组比较无明显变化(表2、图3)。所以本研究将C组D组分别再分成C0和C1组、D0和D1组，C1同D1组作为亚组单独分析(图4)。
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2.2 高压氧对健康大鼠T细胞和细胞因子的影响
B组CD4 T细胞比例同对照组(A组)相比明显减少(P<0.01)，CD8 T细胞基本无变化，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值明显下降(P<0.05)(表1、图1、2)。高压氧明显增加IL-6 (P<0.05)和减少IL-10(P<0.01)。TNF-α基本无变化(表2、图3)。
2.3 高压氧对SIRS大鼠T细胞的影响
高压氧使酵母多糖导致的CD4T细胞减少明显恢复(P<0.05)。同高压氧对健康大鼠T细胞的影响一样，高压氧几乎不影响CD8 T细胞，故CD3+CD4+/CD3+CD8+比值升高(P<0.05)(表1、图1、2)。
2.4 高压氧对SIRS大鼠细胞因子的影响
一方面，与未产生高炎症反应的大鼠组(C0组)比较，三次高压氧(E组)明显增加IL-6(P<0.05)和TNF-α(P<0.01)，而减少IL-10(P<0.05)，这种影响类似于正常组大鼠(图3)。
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