Gαi2对脑缺血—再灌注后神经细胞凋亡的影响(2)
脑缺血-再灌注损伤机制中，细胞内钙超载被认为是细胞死亡的最后共同通路，它促发多种病理损害过程，如炎症、自由基的形成、膜降解、线粒体功能紊乱等，最终介导细胞不可逆性死亡[1]。G蛋白 (G protein)是一种在质膜蛋白中广泛存在的信号转导蛋白，其表达水平及活性的变化相应地调节着细胞生理、生化以及相应基因的表达，在细胞信号转导过程中起着“分子开关”的作用[2-3]。G 蛋白依其结构和功能主要分为刺激性G蛋白(Gs)和抑制性G蛋白(Gi)。抑制性G蛋白α亚单位(Gαi)有3个亚型，即Gαi1、Gαi2和Gαi3。Gαi2具有抑制腺苷酸环化酶(AC)活性作用，与磷脂酶C依赖的磷酸肌醇脂水解、钾通道激活和调节Ca2+通道开放有关。心脏的兴奋收缩偶联中，Gi蛋白介导的信号机制调节钙离子通道。在Gαi2基因敲除和Gαi2蛋白抑制的大鼠中，心肌缺血损伤更严重[2，4]。本实验旨在研究大鼠脑缺血-再灌注损伤中Gαi2的表达变化和对神经细胞内钙离子浓度和细胞凋亡的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、抗Gαi2抗体购自sigma公司，Fluo-3AM钙离子试剂盒购自碧云天公司，流式细胞仪(BECKMANFC500 MPL)。
1.2 动物模型制作及分组
普通级健康雄性SD大鼠90只，体质量200～250 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。10%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，颈正中切口，暴露右侧颈总及颈内外动脉，在距颈总动脉叉1 cm处及远心端结扎颈外动脉并于中间剪断颈外动脉。动脉夹夹闭颈总动脉，于颈外动脉结扎处近心端0.5 cm处剪一切口，将一端稍膨大尼龙线蘸取肝素，由颈外动脉切口向颈内动脉插入至(20±1.5)mm有轻微阻力感停止，颈外动脉游离端近切口处结扎固定线栓，消毒缝合皮肤，并将线栓尾端留置于体外。缺血90 min后，向外抽线栓，使其头端沿颈内动脉回到颈外动脉主干中，恢复大脑中动脉血流。将实验动物随机分为3组，每组27只，各组动物模型建立成功后按再灌注时长分为6、12、24 h 3个亚组，其中PT组为造模前于前囟向后0.8 mm中线旁开1.5 mm处，钻开颅骨并挑破硬脑膜后，用微量注射器垂直进针3.8 mm，于右侧侧脑室内灌注Gαi2活性抑制剂百日咳毒素PT 10 μg/kg，IR组则右侧侧脑室给予等量生理盐水， 假手术组仅暴露三条颈动脉，到相应时间点处死取海马组织。
, 百拇医药
1.3 测定指标
1.3.1 Gαi2蛋白测定 取海马区脑组织，免疫组化法(SABC法)染色Gαi2蛋白。取适量RIPA裂解液匀浆海马组织，测蛋白浓度后，各样品取50 μg/总蛋白上样电泳，行Western blotting。
1.3.2 细胞内游离Ca2+ 浓度测定 大鼠断头处死后冰盘上迅速取脑组织海马区，碎成1 mm的小块，0.25%胰蛋白酶在37.0℃水浴箱中消化后，200 目尼龙网过滤去除细胞团块，离心(1000 r/min，5 min)，弃上清，PBS重悬细胞，加入Fluo-3AM-DMSO标记，流式细胞仪测其荧光值。
1.3.3 细胞凋亡测定 大鼠海马组织TUNEL染色，测定神经细胞凋亡率。
1.4 统计学方法
, 百拇医药 应用SPSS 13.0统计软件分析，数据以均数±标准差(x±s)表示，单因素方差分析(one-way ANOVA)， SNK-q检验 进行两两比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 Gαi2蛋白表达采用免疫组化方法对脑缺血-再灌注损伤模型脑内Gαi2表达进行检测，IR组Gαi2蛋白表达明显增多，见图1。
2.2 Western blotting
相对应时间点，IR组中Gαi2表达量显著高于SS组(P<0.01)，PT组与IR组Gαi2表达量无显著变化(P>0.05)。见图2和图3。
2.3 Ca2+ 浓度
SS组6 h，12 h，24 h海马细胞内游离Ca2+浓度平均荧光值X-mean值分别为1.132±0.463、1.096±0.302、1.072±0.382，IR组中相对应时间点平均荧光值显著高于SS组(P<0.01)，且随着再灌注时间的延长，IR组间和PT组间X-mean值逐渐升高，即Ca2+浓度升高(P<0.01)。相比较IR组相对应时间点，PT组Ca2+浓度降低(P<0.01)(图4和图5)。
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2.4 细胞凋亡
TUNEL染色阳性为细胞呈棕黄色颗粒(图6)，随再灌注时间延长，IR组和PT组的凋亡细胞数逐渐增加；相对应时间点，PT组神经细胞凋亡数较IR组升高(P<0.05)(图6和图7)。
3 讨论
在脑缺血-再灌注损伤过程中，细胞内外Na+/ Ca2+交换异常，钙泵(Ca2+-ATPase)数量及活性下降，炎性反应和大量的自由基损伤生物膜使膜通透性增大及线粒体结构功能障碍等，这一系列的变化将导致神经细胞内Ca2+升高。当Ca2+内流过多和/或胞内线粒体及内质网储存Ca2+释放入胞浆过多时，将引发神经细胞内钙超载 [5-7]。钙超载发生后，一方面线粒体摄取细胞内钙使胞浆内钙向线粒体转移，然而过多的Ca2+与线粒体内含磷酸根的化合物结合形成不可溶性磷酸钙，干扰线粒体的氧化磷酸化，使ATP生成减少[8]。同时Ca2+也可与通透性转运孔相结合，导致线粒体肿胀，功能失调，引起神经细胞死亡或凋亡。另一方面，细胞内游离钙增加，可激活多种钙依赖性的酶促蛋白，包括磷酸二酯酶、腺苷酸环化酶(AC)、CaM依赖性蛋白激酶(CaMPK)，通过基质水解，损伤细胞膜，促进自由基生成、激活非选择性离子通道等途径产生细胞毒性作用引起神经元功能和结构完整性的破坏，最终导致细胞死亡或者凋亡[9-12]。
, 百拇医药(李剑 刘鹏 廖忆刘)
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1.1 试剂及仪器
百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、抗Gαi2抗体购自sigma公司，Fluo-3AM钙离子试剂盒购自碧云天公司，流式细胞仪(BECKMANFC500 MPL)。
1.2 动物模型制作及分组
普通级健康雄性SD大鼠90只，体质量200～250 g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。10%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，颈正中切口，暴露右侧颈总及颈内外动脉，在距颈总动脉叉1 cm处及远心端结扎颈外动脉并于中间剪断颈外动脉。动脉夹夹闭颈总动脉，于颈外动脉结扎处近心端0.5 cm处剪一切口，将一端稍膨大尼龙线蘸取肝素，由颈外动脉切口向颈内动脉插入至(20±1.5)mm有轻微阻力感停止，颈外动脉游离端近切口处结扎固定线栓，消毒缝合皮肤，并将线栓尾端留置于体外。缺血90 min后，向外抽线栓，使其头端沿颈内动脉回到颈外动脉主干中，恢复大脑中动脉血流。将实验动物随机分为3组，每组27只，各组动物模型建立成功后按再灌注时长分为6、12、24 h 3个亚组，其中PT组为造模前于前囟向后0.8 mm中线旁开1.5 mm处，钻开颅骨并挑破硬脑膜后，用微量注射器垂直进针3.8 mm，于右侧侧脑室内灌注Gαi2活性抑制剂百日咳毒素PT 10 μg/kg，IR组则右侧侧脑室给予等量生理盐水， 假手术组仅暴露三条颈动脉，到相应时间点处死取海马组织。
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1.3 测定指标
1.3.1 Gαi2蛋白测定 取海马区脑组织，免疫组化法(SABC法)染色Gαi2蛋白。取适量RIPA裂解液匀浆海马组织，测蛋白浓度后，各样品取50 μg/总蛋白上样电泳，行Western blotting。
1.3.2 细胞内游离Ca2+ 浓度测定 大鼠断头处死后冰盘上迅速取脑组织海马区，碎成1 mm的小块，0.25%胰蛋白酶在37.0℃水浴箱中消化后，200 目尼龙网过滤去除细胞团块，离心(1000 r/min，5 min)，弃上清，PBS重悬细胞，加入Fluo-3AM-DMSO标记，流式细胞仪测其荧光值。
1.3.3 细胞凋亡测定 大鼠海马组织TUNEL染色，测定神经细胞凋亡率。
1.4 统计学方法
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2 结果
2.1 Gαi2蛋白表达采用免疫组化方法对脑缺血-再灌注损伤模型脑内Gαi2表达进行检测，IR组Gαi2蛋白表达明显增多，见图1。
2.2 Western blotting
相对应时间点，IR组中Gαi2表达量显著高于SS组(P<0.01)，PT组与IR组Gαi2表达量无显著变化(P>0.05)。见图2和图3。
2.3 Ca2+ 浓度
SS组6 h，12 h，24 h海马细胞内游离Ca2+浓度平均荧光值X-mean值分别为1.132±0.463、1.096±0.302、1.072±0.382，IR组中相对应时间点平均荧光值显著高于SS组(P<0.01)，且随着再灌注时间的延长，IR组间和PT组间X-mean值逐渐升高，即Ca2+浓度升高(P<0.01)。相比较IR组相对应时间点，PT组Ca2+浓度降低(P<0.01)(图4和图5)。
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2.4 细胞凋亡
TUNEL染色阳性为细胞呈棕黄色颗粒(图6)，随再灌注时间延长，IR组和PT组的凋亡细胞数逐渐增加；相对应时间点，PT组神经细胞凋亡数较IR组升高(P<0.05)(图6和图7)。
3 讨论
在脑缺血-再灌注损伤过程中，细胞内外Na+/ Ca2+交换异常，钙泵(Ca2+-ATPase)数量及活性下降，炎性反应和大量的自由基损伤生物膜使膜通透性增大及线粒体结构功能障碍等，这一系列的变化将导致神经细胞内Ca2+升高。当Ca2+内流过多和/或胞内线粒体及内质网储存Ca2+释放入胞浆过多时，将引发神经细胞内钙超载 [5-7]。钙超载发生后，一方面线粒体摄取细胞内钙使胞浆内钙向线粒体转移，然而过多的Ca2+与线粒体内含磷酸根的化合物结合形成不可溶性磷酸钙，干扰线粒体的氧化磷酸化，使ATP生成减少[8]。同时Ca2+也可与通透性转运孔相结合，导致线粒体肿胀，功能失调，引起神经细胞死亡或凋亡。另一方面，细胞内游离钙增加，可激活多种钙依赖性的酶促蛋白，包括磷酸二酯酶、腺苷酸环化酶(AC)、CaM依赖性蛋白激酶(CaMPK)，通过基质水解，损伤细胞膜，促进自由基生成、激活非选择性离子通道等途径产生细胞毒性作用引起神经元功能和结构完整性的破坏，最终导致细胞死亡或者凋亡[9-12]。
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